Механизмы защиты клетки при дисфункции митохондрий, страница 7

А - моноклональные антитела к ФНО (700 нг/мл) были добавленыодновременно с ФНО (штрихованный столбик) или после совмещения стекол. Каталаза(2500 Е/мл) была добавлена в среду инкубации при совмещении стекол. Б - клетки(индукторные или реципиентные) инкубировали с SkQ1 (20 нМ) в течение 7 дн.40БАРис. 30. Накопление Н2О2 в экспериментах по передаче сигнала апоптоза.Клетки обрабатывали ФНО и SkQ1 как на Рис.

29. А - содержание Н2О2 и апоптозныхклеток на стекле с клетками-индукторами при различных сроках совместной инкубации.Б – эффект SkQ1 на концентрацию Н2О2 в среде совместного роста клеток. Измерениясодержания H2O2 в среде проводили флуориметрически, используя в качествеиндикатора Amplex Red и пероксидазу хрена. Данные получены совместно с М.Ю.Высоких.Измерения уровня H2O2 в среде инкубации показалиего заметноеповышение через 1-4,5 ч после совмещения стекол. Обработка клеток-индукторовс помощью SkQ1 снижала уровень H2O2, в то время, как обработка реципиентныхклеток не давала эффекта (Рис. 30).Полученные данные позволяют предполагать, что основным фактором передачисигнала апоптоза между клетками является пероксид водорода, которыйобразуется в митохондриях и выходит во внеклеточную среду. Проникая вреципиентные клетки, H2O2 вызывает накопление АФК при участии митохондрийи эти «вторичные» АФК, в свою очередь, инициируют апоптоз (Схема.

3).Описанный выше механизм межклеточной передачи сигнала апоптоза можетиграть важную роль в защите органов и тканей от повреждения. Апоптозотносительно небольшого числа клеток вокруг первичного очага поражениядолжен препятствовать распространению повреждающего воздействия на болеезначительные области ткани.

Аналогичный способ защиты существует у высшихрастений, где гибель клеток вокруг очага заражения вирусами или микробамипрепятствует распространению патогенна. Интересно, что ведущую роль впередаче сигнала о гибели в этом случае так же играет пероксид водорода.41Схема 3.Передача сигнала апоптозамежду клетками.В процессе апоптоза (вызванного,например, ФНО или H2O2) в клеткахиндукторах (стадии 1-3) происходитгенерация H2O2 внутри митохондрий(стадия 4). В цитозоле клетки H2O2усиливает апоптозные процессы (стадия5), а, выйдя во внеклеточную среду(стадия 6) атакует клетку-реципиент(стадия 7). В клетке-реципиенте H2O2проникает в митохондрии (стадия 8) истимулирует в них продукцию H2O2(процесс, аналогичный стадии 4), чтоприводит к развитию апоптоза.SkQ1 ингибирует продукцию H2O2 вмитохондриях (9) и предотвращает каквыработку, так и восприятие сигналаапоптоза.

Разобщитель окислительногофосфорилирования FССP предотвращаетнакопление SkQ1 в митохондриях и егозащитное действие (10).ЗаключениеПроведенные нами исследования раскрыли сложную многоступенчатуюсистему защиты клеток от повреждений, связанных с дисфункцией митохондрий.Этасистемавключаетмолекулярныемеханизмы,предотвращающиенепродуктивный гидролиз АТР и антиоксидантные ферменты, призванныенейтрализовать угрозу и справляющиеся с этой задачей при нормальномфункционировании клетки. При стрессовых воздействиях и при различныхпатологических состояниях этой защиты оказывается недостаточно и в клеткевключаютсямеханизмы,митохондрий(митоптоз).направленныеЕслиэтинаусилияэлиминациюнеповрежденныхобеспечиваютнормальноефункционирование клетки, то запускается апоптоз.

Даже кратковременное инеполное снижение уровня АТР индуцирует клеточное самоубийство. Избыточнаяпродукция АФК в митохондриях так же является сигналом к апоптозу. Повидимому, дисфункция митохондрий опасна не только для жизни клетки, но и дляорганизма в целом; чревата нарушением функций клетки и их перерождением.Наши результаты свидетельствуют о том, что митохондрии служат важнейшимсенсором,способныминициироватьапоптоз.Митохондрии,по-видимому,способны воспринимать разнородные сигналы, поступающие из внеклеточнойсреды (через специфические рецепторы, как в случае цитокинов, или без них, как42при физических стрессах) и от других клеточных структур (таких как ядро,цитоскелет, ретикулум и др.), суммировать их, перерабатывать с учетом особыхпро- и анти- апоптотических механизмов и выдавать унифицированный сигнал,который может практически неизбежно вести к гибели клетки. Более того,выработка АФК в митохондриях участвует в формировании межклеточногосигнала, вызывающего коллективное самоубийство окружающих клеток.

Этотзащитный механизм должен препятствовать распространению повреждающеговоздействиянаболеезначительныеобластиткани.Описанныенамимногочисленные защитные механизмы ослабевают при старении и оказываютсянеэффективны при развитии различных патологий. Кроме того, чрезмерныезащитные реакции (в частности индивидуальный и коллективный апоптоз) могутлежать в основе нарушения жизненных функций организма. Описанные в нашейработе митохондриально-направленные антиоксиданты могут стать важнейшиморужием в борьбе с патологиями, связанными с дисфункцией митохондрий.43Выводы1. Показано, что при повреждении мембраны митохондрий активируются двамеханизмарегуляциимитохондриальнойАТРсинтазы:образованиенеактивного комплекса с ADP и переход комплекса с белком-ингибитором внеактивное состояние. Эти механизмы способны эффективно тормозитьнепродуктивный гидролиз АТР в митохондриях.2.

Временное и неполное снижение уровня АТР индуцирует апоптотическуюгибель клеток.3. Показано, что при окислительном стрессе митохондрии служат основнымисточником активных форм кислорода (АФК).4. Показано,чтоокислительноеповреждениеприводиткоткрытиюнеселективной циклоспорин-чувствительной поры во внутренней мембранемитохондрий. Открытие поры контролируется уровнем восстановленостиглутатиона и NAD(P)H в митохондриях.5. Накопление АФК в митохондриях приводит к их обратимой фрагментации ираспаду единой электрической митохондриальной сети.6.

Продолжительноеповреждениемитохондрийведеткихэлиминации(митоптозу). При массовом повреждении митохондрии формируют крупныекластеры в перинуклеарной области, которые затем выбрасываются из клеткипо механизму сходному с экзоцитозом.7. Накопление АФК в митохондриях при окислительном стрессе приводит киндукции апоптоза. Инициация апоптоза связана с перемещением белка ВАХизцитоплазмытранслокаторавмитохондрии.адениновыхЭтотпроцесснуклеотидоввозависитотвнутреннейокислениямембранемитохондрий.8. Образование АФК в митохондриях приводит к выработке межклеточногосигнала, вызывающего апоптоз окружающих клеток.9.

Новыемитохондриально-направленныеантиоксидантывнаномолярныхконцентрациях защищают митохондрии от окислительного повреждения ифрагментации,предотвращаютапоптозпривыработку межклеточного апоптозного сигнала.44окислительномстрессеиОсновные публикации.1.

Черняк Б.В., Козлов И.А. Локализация каталитического центра Н+-АТФазы вмитохондриальной мембране. ДАН ССР (1976) 231, 222-225.2 .Козлов И.А., Черняк Б.В. Взаимодействие бифункциональных сшивающих реагентов срастворимой митохондриальной АТФазой. ДАН ССР (1978) 238, 1479-1482.3. Chernyak, B.V., Kozlov, I.A. Adenilylimidodiphosphate release from the active site ofsubmitochondrial particles ATPase. FEBS Lett., (1979) 104, 215-219.4. Chernyak V.Ya., Kozhanova Z.E., Chernyak B.V., Kozlov I.A. Investigation of solublemitochondrial ATPase by the reacting enzyme.

Eur. J. Biochem. (1979) 98, 585-589.5. Chernyak, B.V., Chernyak, V.Ya., Gladysheva, T.B., Kozhanova, Z.E., Kozlov, I.A.Structural rearrangements in soluble mitochondrial ATPase. Biochim. Biohys. Acta, (1981) 635,552-570.6. Козлов И.А., Черняк Б.В. Мембранный потенциал и синтез АТР на сопрягающихмембранах.

Успехи Биол. Химии (1983) 24, 65-82 (Обзор).7. Гладышева Т.Б., Козлов И.А., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Исследование влияниямембранного потенциала на скорость гидролиза АТФ в субмитохондриальных частицах.ДАН ССР (1984) 276, 980-983.8. Chernyak B.V., Khodjaev E.Yu., Kozlov I.A. The oxidation of sulfhydryl groups inmitochondrial F1-ATPase decreases the rate of its inactivation by the natural protein inhibitor.FEBS Lett. (1985) 187, 253-256.9. Козлов И.А., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Редокс регуляция взаимодействиямитохондриальной Н+-АТРазы с природным белковым ингибитором.

ДАН СССР (1985)281, 1482-1484.10. Chernyak B.V. Kozlov I.A. Regulation of H+-ATPases in oxidative phosphorylation andphotophosphorylation. Trends in Biochem Sci. (1986) 11, 32 – 39 (Обзор).11. Духович В.Ф., Козлов И.А., Левит М.Н., Ходжаев Е.Ю., Черняк Б.В. Почемупреинкубация митохондрий гепатомы с разобщителями вызывает снижение АТРазнойактивности. Биол. Мембр.

(1986) 3, 506-512.12. Черняк Б.В., Духович В.Ф., Ходжаев Е.Ю. Что определяет скорость гидролиза АТР вмитохондриях. ДАН СССР (1987) 294, 497-499.13. Chernyak B.V., Dukhovich V.F., Khodjaev E.Yu. The effect of the natural protein inhibitoron H+-ATPase |in hepatoma 22a mitochondria. FEBS Lett. (1987) 215, 300-304.14. Chernyak B.V., Dukhovich V.F., Khodjaev E.Yu. The interaction of MgADP with H+ ATPase in rat liver mitochondria.