Механизмы защиты клетки при дисфункции митохондрий, страница 6

22. Фазовый контраст, флуоресцентная микроскопия и сканирующаяэлектронная микроскопия клеток обработанных в течении 96 ч ДНФ (0,4 мM) иантимицином (2 мкM).Митоптотическое тельце ярко окрашено Митотракером зелёным и отчетливо видно нафазовом контрасте (А, Г). Сканирующая микроскопия клетки с митоптотическим тельцемна поверхности (Б, В) и клетки с «кратером», оставшимся после того как митоптотическоетельце отделилось в процессе фиксации препарата.

Масштаб, 15 мкм (А,Г) , 10 мкм (Б,Д), 3 мкм (В, Е).7. Апоптоз, как защитный механизм при окислительном стрессеВ предыдущих разделах мы рассмотрели некоторые механизмы защитыклетки от дисфункции митохондрий при окислительном стрессе. В том случае,если все эти меры не предотвращают развитие окислительных повреждений, в33клетке может быть индуцирована программа апоптоза – самоубийства клетки,призванного не допустить повреждения окружающей ткани.

Митохондрии могутиграть роль сенсоров измеряющих силу окислительного стресса и определяющихтот порог, за которым происходит индукция апоптоза. Кроме того митохондриинепосредственно участвуют в реализации программы апоптоза, и их состояние вомногомопределяетнаступлениемоментанеобратимойгибеликлетки.Центральную роль в процессе апоптоза, вызванного окислительным стрессом,играет продукция АФК в митохондриях описанная нами выше. Основнымиинструментами для изучения этих явлений, как и в предыдущих экспериментах,служилиингибиторымитохондриальныхфункцийимитохондриально-направленные антиоксиданты (см. Рис.

7).7. 1. Общие характеристики апоптоза, вызванного окислительным стрессом.В качестве основной модели окислительного стресса в клетках HeLa и вфибробластах мы использовали обработку H2O2 в концентрациях 100 - 500 мкM.Сходныерезультатыпрооксидантовбылименадиона,полученыпаракватаприиспользовании(метилвиологена)ивкачествеорганическихгидроперекесей. Мы обнаружили, что через 24 часа после добавки малых дозпрооксидантов значительно возрастало количество клеток в G2/М фазе, чтоуказывало на торможение клеточного цикла. При дальнейшей инкубации H2O2разлагался и происходило частичное восстановление клеточного цикла.

Есликлетки HeLa культивировали при низкой плотности (конфлюэнтность 30-40%) тоH2O2 в концентрации 200 мкМ вызывал гибель 20-30% клеток через 17 часовпосле добавления. Эффект пероксида водорода значительно усиливался, есликлетки предварительно инкубировали с ингибиторами дыхания пиерицидином илимиксотиазолом. Преинкубация с митохондриально-направленным антиоксидантом(SkQ1, 20 нМ, 7 дн) предотвращала гибель клеток, но лишь в отсутствиеингибиторов дыхания (Рис.

23). Аналогичные эффекты наблюдались и дляфибробластов человека, но защитное действие SkQ1 не требовало стольдлительной инкубации (Рис. 24). Эти данные полностью коррелировали сизмерениями уровня АФК в тех же клетках, обработанных H2O2 (см. выше). Такимобразом,гибельклетокприокислительномстрессе,вызванномH2O2,определялась вторичной продукцией АФК в митохондриях.ГибельклетокHeLaимелавсепризнакиапоптоза:ядраимеликонденсированный и фрагментированный хроматин, ДНК была фрагментирована,34на поверхности клеток экспонировался фосфатидилсерин.

Появления всех этихпризнаков не наблюдалось в присутствии ингибитора каспаз zVAD-fmk. Прикомбинации ингибиторов дыхания и Н2О2, наблюдалось появлениебольшогоколичества клеток с нарушенной целостностью внешней мембраны (окрашиваниейодистым пропидием), что является характерным признаком некроза.Рис.

23. Гибель клеток HeLaЭффектывызваннаяН2О2.ингибиторов дыхательной цепии SkQ1.Апоптотическая и некротическаягибель измерялась как на Рис. 5через 17 ч после добавленияН2О2 (200 мкM). Пиерицидин(пиер., 2 мкM), миксотиазол(миксо., 2 мкM) и zVADfmk (50мкM) добавляли за 1 час доН2О2. Клетки инкубировали с 20нМ SkQ1 в течение 7 дней,затемпромывалиикультивировали еще 24 ч.В случае фибробластов некроз наблюдался и в отсутствие ингибиторов дыхания.В обеих моделях zVAD-fmk предотвращал развитие некроза, что указывало на еговторичную природу (Рис. 23).АБРис.24.

SkQ1 и SkQR1 предотвращают гибель фибробластов вызванную H2O2.Фибробласты инкубировали с SkQ в течение 24 ч, затем добавляли H2O2 (0.3 мМ) иизмеряли гибель клеток через 24 ч. А - С12ТРР, аналог SkQ, лишенный антиоксидантнойфункции, Б – FССP (1 мкМ) добавлен одновременно с SkQ1 (2 нМ).Апоптоз в клетках HeLa сопровождался перемещением белка BAX изцитоплазмы в митохондрии и выходом цитохрома с в цитоплазму (Рис. 25).Экспрессия антиапоптозного белка Bcl-2 предотвращала выход цитохрома с и35защищала клетки HeLa от гибели под действием Н2О2. В то же времяперемещение ВАХ не тормозилась под действием Bcl-2.

Эти данные показали, чтоперемещение ВАХ предшествует выходу цитохрома с из митохондрий приокислительном стрессе, что согласуется с результатамиже многочисленныхисследований, проведенных на других моделях апоптоза.Рис. 25. Транслокация Bax в митохондрии и выход цитохрома с в цитоплазму поддействием Н2О2.Клетки HeLa обрабатывали Н2О2 (200 мкМ) и анализировали через 17 ч. ВАХ и цитохромс окрашивали с помощью специфических антител, а ядра с помощью Hoechst 33342.Миксотиазоли zVAD-fmk были добавлены как на Рис.

23. Стрелками показаныапоптозные клетки. Масштаб, 15 мкм.7.2. Механизм запуска апоптоза при окислительном стрессе. Роль белка ВАХ.Мы обнаружили, что уже через два часа после добавки Н2О2 фракция BAX вмитохондриях увеличивается, а его содержание в цитоплазме снижается.Перераспределение BAX на эти сроки не сопровождалось выходом цитохрома сиз митохондрий в цитоплазму и проявлением других признаков апоптоза.36Оказалось, что кратковременная преинкубацмя с SkQ1 (20 нМ, 2 часа)предотвращает транслокацию BAX, вызванную окислительным стрессом (Рис.26). Антиоксидант общего действия Trolox также обладал защитным действием,но в значительно больших концентрациях (0,1 мМ).

Как и в случае фрагментациимитохондрий,быстроеразвитиеэффектаSkQ1указываланато,чтотранслокация ВАХ определяется уровнем АФК внутри митохондрий. Этот выводнаходится в кажущемся противоречии с представлениями о том, что ВАХполучает сигнал, ведущий к транслокации, находясь в цитоплазме. Дальнейшиеэкспериментыпозволилиразрешитьэтопротиворечие.Рис. 26.

Накопление АФК в митохондриях вызывает перераспределение белка BAXв клетке.Клетки HeLa преинкубировали с SkQ1 (2 нМ, 2 ч), затем обрабатывали Н2О2 (250 мкМ,20 ч). Окраска, как на Рис. 25. Масштаб, 15 мкм.Известно,локализованнымичтовBAXобластиприапоптозеконтактавзаимодействуетвнешнейисбелками,внутреннеймембранмитохондрий (комплекс «контактных сайтов»).

Одним из белков, участвующих вобразовании этого комплекса, является транслокатор адениновых нуклеотидов(ANT). Мы исследовали влияние конформации ANT на транслокацию BAX приокислительном стрессе, использовав ингибиторы ANT, бонгкрековую кислоту иатрактилозид, фиксирующие транслокатор в различных конформациях. Было37обнаружено, что бонгкрековая кислота предотвращает транслокацию BAXвызваннуюпероксидомводорода.Атрактилозид,напротив,вызывалтранслокацию BAX на мембрану митохондрий в значительной части клеток вотсутствие H2O2 и усиливал действие H2O2 на транслокацию ВАХ.

В присутствииатрактилозида SkQ1 уже не влиял на перемещение ВАХ (Рис. 27).Ингибиторы ANT были использованы для изучения возможной взаимосвязимежду транслокацией BAX и фрагментацией митохондриального ретикулума приокислительномстрессе.Несмотрянато,чтобонгкрековаякислотапредотвращала транслокацию BAX, она никак не влияла на фрагментациюмитохондрий, вызванную Н2О2.

Бонгкрековая кислота так же не подавлялаапоптоз, вызванный Н2О2 в клетках HeLa. Можно полагать, что транслокация BAXприокислительномстрессенеявляетсянеобходимымусловиемдляфрагментации митохондрий и для апоптоза. По-видимому, в митохондрияхсуществуют и иные мишени для действия АФК, ответственные за эти процессы.АБРис. 27. Конформация транслокатора адениновых нуклеотидов определяетлокализацию BAX в клетках HeLa.А - клетки инкубировали с бонгкрековой кислотой (10 мкМ, 2 ч), затем добавляли H2O2(300 мкМ). Б - клетки инкубировали с SkQ1 (2 нМ, 2 ч), затем добавляли атрактилозид(100 мкМ) и H2O2 (300 мкМ).

Клетки фиксировали через 24 ч и окрашивали, как на Рис.25. Масштаб, 4 мкм.Посколькуатрактилозидспособствуетоткрытиюциклоспорин-чувствительной митохондриальной поры, а бонгкрековая кислота ее закрытию, мыисследовали роль поры в транслокации ВАХ. Для этого были использованыингибиторы митохондриальной поры циклоспорин А и его аналог N-метил-4изолейцин-циклоспорин, обладающий более селективным действием. Было38показано, что оба ингибитора не влияют на изменение локализации ВАХ приокислительномстрессе.Следовательно,определяющимфакторомвтранслокации ВАХ является конформация ANT, а не состояние поры. Этот выводсогласуется с данными, полученными на частично очищенных препапратах«контактных сайтов», где изменение конформации ANT вызывало изменениесродства ВАХ к комплексу в целом (Vyssokikh et al., 2002).

Известно, чтоокисление дитиола на матриксной стороне молекулы АNT может приводить кизменению его конформации, подобно атрактилозиду. Возможно, окислительныйстресс вызывает окисление этого дитиола, что и приводит к увеличению сродстваАNT к ВАХ. SkQ1, в таком случае, мог бы предотвращать транслокацию ВАХ,защищая дитиол АNT от окисления. Таким образом, молекула транслокатораадениновых нуклеотидов может играть роль сенсора, чувствительного к АФКвнутри митохондрий и инициирующего апоптоз при окислительном стрессе.7.3.Митохондриальные АФК участвуют в передаче апоптозного сигналамежду клеткамиИзучая апоптоз клеток HeLa, вызванный пероксидом водорода, мыобратили внимание на то, что апоптозные клетки распределяются в монослойнойкультуреклетокнеслучайнымобразом,аформируюткластерыизблизкорасположенных клеток.

Это указывает на наличие сигнала, передающегосяот погибающих клеток к соседним клеткам и способного вызывать их гибель. Дляпроверки этой гипотезы мы использовали модель, в которой были исключеныпрямые межклеточные контакты. Клетки-индукторы и клетки-реципиенты растилина двух разных стеклах в разных чашках, далее одно из стекол обрабатывалиH2O2, и после инкубации и промывки помещали рядом с другим стеклом в общуючашку Петри в среде, содержавшей ингибитор каталазы, аминотриазол.

В этихусловиях после 18 ч совместной инкубации наблюдался значительный апоптоз вклетках-реципиентах (Рис. 28). Длительная инкубация клеток-реципиентов с SkQ1(20 нМ, 7 дн) предотвращала их гибель. Эти данные указывали на то, что именноН2О2 является сигнальной молекулой в этой модели.Далее мы использовали другой индуктор клеточной гибели - факторнекроза опухоли (ФНО).

На Рис. 29 показаны результаты опыта, в котором клеткииндукторы инкубировали 3ч с ФНО в комбинации с ингибитором синтеза белка,эметином (необходимым для индукции апоптоза), промывали, помещали рядом склетками-реципиентами и продолжали инкубацию в течение 17ч. Что бы39исключить возможный эффект перераспределения молекул ФНО между стеклами,совместную инкубацию проводили в присутствии моноклональных антител к ФНО.Добавление в среду инкубации каталазы (фермента, специфически разлагающегоH2O2) эффективно подавляло апоптоз клеток на стекле-реципиенте и при этом невлияло на апоптоз клеток на стекле-индукторе (Рис. 29А).Рис.28.Передачасигналаапоптоза от клеток, обработанныхH2O2.Клетки HeLa обрабатывали 50 мкMH2O2 3 раза с интервалом в 1 ч ипромывали.Клетки-реципиентысовмещали с клетками-индукторамина 8 ч.

В среде присутствоваламинотриазол (7 мМ). SkQ1 (20 нМ)былдобавленкклеткамреципиентам за 7 сут до совмещениястекол и затем присутствовал втечение 18 ч совместной инкубации(черные столбики).Для проверки возможной роли митохондрий в продукции H2O2 при передачеапоптозного сигнала от клеток обработанных ФНО был использован SkQ1.Передача сигнала апоптоза была подавлена, как при обработке с помощью SkQ1индуктора, так и реципиента. В то же время, SkQ1 практически не влиял наразвитие ФНО - зависимого апоптоза на стекле индукторе (Рис. 29Б).АБРис. 29. Передача сигнала апоптоза от клеток, обработанных ФНО (10 нг/мл) иэметином (1 мкM), к интактным клеткам. Апоптоз определяли через 24 ч послесовмещения стекол.