Отзыв официального оппонента 2 (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов)

Отзыв официальног о оппонента на диссертационную работу Макарова Дмитрия Александровича «Разработка технологий получения рекомбинаитного тимозина бета-4 человека и его аналогов», представленную на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 03,01А)6 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Тимозин бета 4 Щ4) считается наиболее распространенным, изученным и биологически активным членом семейства р-тимозинов. Он регулирует полимеризацию актина и активирует клеточную мшрацию, которая важна для процесса ангиогенеза и регенерации поврежденных тканей.

В разных клеточных моделях и на уровне организма было показано, что молекула Тр4 обладает уникальными кардиопротекторными свойствами, принимает участие в стимулировании роста сосудов в условиях ишемии сердечной мышцы. блокирует в кардиомиоцитах проапоптотические каскады и, наоборот, активизирует внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за выживаемость клеток в условиях стресса.

Активность этого пептида интенсивно изучается для лечения трофических язв, ран и ожогов роговицы глаза человека. Благодаря противовоспалительным свойствам Т))4 зарекомендовал себя как действующее вещество в препаратах для лечения воспаления кожи — хронических дерматитов. Однако. исследование биораспределения Тр4 по органам мыши выявило, что концентрация Тр4 в сыворотке крови мыши падает до исходного состояния уже через 40 минут после введения пептида, а через 2 часа Тр4 практически полностью выводится из организма, поэтому в настоящее время перспективным направлением является создание лекарственных форм на основе Тр4 с устойчивой и пролонгированной активностью.

Таким образом, получение аналогов Тр4 с улучшенными фармакокинетическими показателями весьма актуальна. Целью диссертационной работы Дмитрия Александровича была разработка эффективной биотехнологии производства рекомбинантного тимозина р-4 человека и его аналогов с улучшенными фармакокинетическими показателями. Для достижения поставленной цели диссертант поставил 4 задачи.

в которые входило: разработать эффективную биотехнологию пилотного производства рекомбинантного Тр4 человека: изучить биологическую активность рекомбинантного Тр4 человека; синтезировать аналоги рекомбинантного Т))4 с улучшенными фармакокинетическими показателями и разработать эффективный способ их очистки; разработать биотехнологический метод получения рекомбинантного Т))4 человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида. Научная новизна. Синтезированы три аналога рекомбинантного Т~)4 человека с улучшенными фармакокинетическими показателями. Разработан эффективный способ очистки аналогов рекомбинантного Тр4 человека с использованием методов ОФ В.)ЖХ.

Исследована биологическая активность рекомбинантного Тр4 человека на спонтанной мышиной модели хронического дерматита и показана его эффективность в лечении хронических заболеваний кожи. Впервые разработана простая и легко масштабируемая технология получения рекомбинантного Тр4 человека с использованием интеинопосредованной экспрессионной системы, обеспечивающая селективное высокоэффективное ацетилирование рекомбинантного Тр4 п1 ляо.

Практическая значимость. Разработана технология ацетилировання псптида п1 лап, обеспечивающая эффективный и экономичный способ получения рекомбинантного Т114 человека. С использованием разработанной пилотной технологии производства рекомбинантного ТР4 человека была получена опьиная партия в размере 2.5 рекомбинантного ТР4 человека для медико-биологических испытаний. На разработанные технологии и продукты получено 4 патента, Диссертация состоиг из разделов «Введение», «Оозор литературы». «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».

Текст изложен на 100 страницах, сопровождается 44 рисунками и 10 таблицами. Список литературы включает 185 публикаций. Работа написана по традиционному плану, изложение достаточно четкое и последовательное. Обзор литературы, изложенный на 21 страницах, включает анализ отечественных и иностранных источников.

В обзоре изложены как фундаментальные сведения. так и проблемы практического применения, это делает его интересным и насыщенным. Обзор литературы состоит из двух разделов. В первом диссертшгг подробно описал структуру и свойства тимозинов, способы их получения и ацетилирования. во втором подробно рассказано о биологической активносги ТР4, механизмах его регуляции, стратегия доставки и контролируемого высвобождения в тканях и наконец применение в клинике. В целом литературный обзор охватывает необходимый и достаточный для понимания проблемы круг вопросов.

Перехожу к характеристике собственно результатов соискателя. Их изложение начинается с описания материалов и методов, использованных в работе, ".Этот раздел дает представление о высоком современном методическом уровне работы. Автор успешно сочетает разнообразные химические. биохимические, микробиологические и молекулярно-биологические подходы для решения поставленных задач.

Следует подчеркнуть, что введение каждого нового метода в работу не было излишеством и не представляло собой погоню за распространением арсенала современных методов. а явилось неизбежным логическим следствием решения конкретных научных задач. Результаты и обсуждение. Этот раздел (именуемый почему-то в автореферате «Обсуждение резуль гатов») начинается с оптимизации и масштабирования лабораторного метода получения рекомбинантного ТР4 человека до пилотного производства. Нздо отметить, что, как белок, Т~14 человека крайне проблемный объект, как для химического пептидного синтеза, для которого он слишком длинный и дорогой в производстве, так и для микробиологического, для котороро 'он слишком короткий и неустойчивый к протеазам бактерий. Для его получения соискатель первоначазьно использует стандартные генно-инженерные подходы, основанные на получении слитного продукта с белком носителем с последующим отрезанием от него с помощью специфической протеазы.

Диссертантом были оптимизированы и масштабированы стадии культивирования штамма-продуцента. разрушения клеточной биомассы, хроматографической очистки. протеолитического расщепления и ацетилирования дезацетилтимозина бета 4. Выход каждой операции составлял 90-95% и только эффективность процедуры и ацилирования составляла 87%. Итоговый выход продукта составил 55% от исходного. После масштабирования и оптимизации технологии получения рекомбинантного Т~Э4 человека, суммарный выход целевого продукта увеличился с 20 до 80 мг с 1 л культуральной жидкости. Следующим направлением деятельности Дмитрия Александровича стало получение аналогов Тр4 с пролонгированным временем жизни.

Из литературных источников известно, что биологической активностью обладает не только ацетилированная форма пептида, но и неацетилированная форма рекомбинантного Тр4 человека. Апетильная группа, присоединяемая в результате посзтрансляционной модификации к первой аминокислоте Тр4 - серину, никак не связана с биологической активностью пептида и необходима только для увеличения продолжительности его жизни в токе крови. Замена этой группы на другие стабилнзнруюшие группы является наиболее логичным подходом к разработке селективного способа получения аналогов Тр4 с пролонгированным временем жизни.

Соискателем были оптимизированы н масштабированы стадии гексаноилирования. сиалирования и пегилирования дезацетилтимозина бета-4. Выход каждой процедуры модификации составлял 30%, 55% и 65% от исходного. Структура полученных аналогов была подтверждена пептидным картированием. Продукты протсолиза анализировали с помошью ОФ ВЭЖХ. В результате протеолитического расщепления в совокупности с хромато-масс-спектрометрическим анализом протеолитической смеси бьшо доказано, что все полученные аналоги Тр4 являются его модификациями по М-концевому серину.

Стаоильность полученных Тр4 и его аналогов была определена в сыворотке крови кролика. Исследование кинетики деградации Тр4 и его производных показало, что время, за которое содержание пептнда уменьшилось вдвое для Тр4 соответствует 2 ч., для моногексаноилтимозина бета 4 соответствует 8 ч, для моносиалированного Т~4 соответствует 6 ч. и для моноНЭГилированного Тр4 соответствует 10 ч. Таким образом, все аналоги Тр4 показали увеличенное время жизни в сыворотке крови кролика, а соискателем была создана целая коллекция производных тимозина для различных медицинских приложений.

Казалось бы, Дмитрию Александровичу удалось удачно преодолеть «Долину смерти», ожидающую каждую научную разработку, и сделать вполне качественные биотехнологические продукты. Но диссертант на этом не остановился. Апофеозом данной диссертации является разработка интеин-опосредованного метода для производства рекомбинантного Тр4 из ацетилированного и иго гибридного белка. Химический способ модификации Х-концевого серина Тр4 ангидридом уксусной кислоты не является единственным способом селективного ацетилирования пептида, Все мы знаем, какой большой проблемой является работа с этим соединением. Альтернативным подходом является ферментативный метод ацетилирования. в котором роль ацетилирующих ферментов играют ферменты из класса М-ацетилтрансфераз. использующие в качестве субстрата кофермент — ацетилкоэнзим А, но высокая стоимость кофермента делает промыппенное получение Т~54 методом ферментативного ацетилирования ш лгго нерентабельным.

Наиболее перспективным с точки зрения производства представляется ацетилирование пептида п1 лю. при котором мог бы использоваться ацетилкоэнзим А самой клетки. Для того чтобы создать экспресснонную систему, обеспечивающую синтез гибридного белка параллельно с Х-ацетилтрансферазой, были клонированы последовательности кодирующие гибридный белок ТЬ40угА и М-ацетилтрансферазу в полицнстронную конструкцию. Также в вектор клонировали олигонуклеотидный дуплекс, содержащий измененную последовательности Шайна — Дальгарно необходимую для ослабления экспрессии второго гена в полицистронной конструкции.

В качестве ацетилирующих ферментов выбрали аланиновую и сериновую М-ацетилтрансферазы Езсйепсй~а с ой Сконструированные рекомбинантные плазмиды рЕК вЂ” ТЬ4ОутА — АсА1а и ро†ТЬ4ОугА-Аскет бьши использованы для трансформации и экспрессии в штаммах ЕсоЕ Злектрофоретический анализ показал, что при индукции в штаммах — продуцентах образовывался гибридный белок ТЬ4бугА в растворимой форме, и параллельно с гибридным белком синтезировалась сериновая или аланиновая ацетилтрансферазы. Спонтанное расщепление гибридного белка и лко отсутствовало.

Бьш отобран штамм, в котором наиболее эффективно происходило ацетилирование целевого пептида. Большой удачей данной разработки является полное удаление формилметионина с Х вЂ” конца целевого пептида в штаммах-продуцентах в процессе посттрансляционной модификации, независимо от условий культивирования. В результате многофакторного эксперимента бьши выбраны условия, при которых выход РР4 достигал 74% от исходного количества предшественника. Далее было проведено исследование кинетики ацетилирования пептида в штамме-продуценте ТЬ4ОугА †Аск. Через 20 часов после индукции доля ацетилированного предшественника рекомбинантного Т114 человека выросла до 93% от исходного количества дезацетилтимозина бета 4 и далее не увеличивалась.