Отзыв ведущей организации (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов)

ФАНО РОССИИ ФЕДЕРДЯЬНОЕ ГОСУДДРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОссийскОЙ дкддевии нАук 1231 82 Москва, пл. Акад. Курчатова, д. 2 Тал. (499П96.0000, Факс (499)196.0221, аккчкклд.таа.то, ЕчлаК: алд©алдтавто ИНН~КПП 773402167й773401001, ОКПО 04683332, ОГРН 1027739480966 и На № учной работе генетики РАН некий ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ на диссертационную работу Макарова Дмитрии Александровича «Разработка технологий получении рекомбинантного тимознна бета-4 человека и его аналогов», представленную на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 03.01.0б— Биотехнологии (в том числе бионанотехнологи~) Ж1т.1ыьиость. Диссертантом Макаровым Д.А.

была проведена научно- квалификационная работа, тема которой в настоящее время является крайне актуальной, поскольку обусловлена необходимостью разработки методов ' получения многофункционального рекомбииантного пептида тнмозина бета-4 (ТР4) человека, принимающего участие в стимулировании ангиогенеза в условиях ишемии сердечной мышцы, блокирующего в кардиомиоцнтах проапоптотические каскады и, наоборот, активизирующего внугриклеточные сигнальные пути, ответственные за выживаемость клеток в условиях стресса. Активность этой молекулы также проявляется прн лечении трофических язв, ран и ожогов роговицы глаза человека.

Благодаря противовоспалительным свойствам ТР4 зарекомендовал себя как действующее вещество в препаратах для лечения признаков воспаления кожи— хронических дерматитов. Таким образом, ТР4 обладает высоким терапевтическим потенциалом для применения в качестве лекарственного препарата прн лечении широкого спектра заболеваний. В мировой практике часто применяются методы химической модификации фармацевтических белков, для того чтобы улучшить нх фармакокинетические показатели, поэтому важным является вопрос получения аналогов ТР4 с пролонгированным действием.

Со е жаиие аботы. Рецензируемая работа изложена на 100 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Во введении диссертант обосновывает выбор темы и еб актуальность, определяет цель и задачи работы, формулирует цель и задачи исследования, раскрывает научную новизну и практическую значимость диссертационной работы, указывает количество публикаций и апробаций по результатам исследований. Представленный обзор литературы отличается полнотой и непосредственно связан с темой исследования.

Обзор литературы посвящен описанию молекулы Тр4 человека, еб физико- химическим и биологическим свойствам, а также описаны все возможные способы ед получения на сегодняшний день. В начальных главах литературного обзора описана история открытия семьи бета тимозинов, их свойства и конкретно Тр4, его структура, способы получения и биологическая активность. В заключительных главах проведен обзор молекулярных механизмов, регулируемых активностью Т~34, способы доставки Тр4 к тканям, отдельная глава посвящена сульфоксиду Т~34 и его биологической активности. Также в заключительной части обзора литературы присутствуют главы, объясняющие многофункциональные свойства пептида и способы его применения.

В целом, обзор дает полное представление о пептиде Тр4 и способах его получения и служит хорошим введением к изложению собственных результатов автора. В экспериментальной части автором приведены современные методы выделения и очистки рекомбинантных белков, а также аналитические методы, используемые в диссертационной работе.

Подробно и последовательно описаны ключевые методики по наращиванию биомассы, выделению целевого гибридного белка и его расщепления, пробоподготовке субстанций, химической модификации белков, а также методика проведения хроматографии. Все представленные данные получены Макаровым Д.А. в результате корректно выполненных и подробно изложенных экспериментов. Часть «результаты и обсуждение» включает разделы, которые отражают последовательное выполнение обозначенных диссертантом задач, На первом этапе исследований Макаровым Д.А. была оптимизирована и масштабирована лабораторная методика получения Т~34.

Разработан лабораторный регламент получения рекомбинантного пептида, позволяющий получить 80 мг целевого пептида с 1 л культуральной жидкости. В ходе оптимизации лабораторная методика подверглась значительным изменениям, так, например, культивирование вместо качалочных колб проводили в 250 л ферментере, что привело к значительному увеличению выхода биомассы. Добавлена стадия термического осаждения балластных белков, приведшая к обогащению клеточного лизата гибридным белком, что в свою очередь увеличило эффективность анионообменной хроматографии.

Неэффективная тангенциальная ультрафильтрация, использующаяся в лабораторной методике для разделения целевого пептида и остаточного белка, заменена на более эффективную ионообменную хроматографию. Оптимизирован процесс химического ацетнлирования Т~34, подобраны такие условия, при которых потери целевого пептида были минимальны. Таким образом, результатом оптимизации лабораторной методики стало увеличение выхода Тр4 в 4 раза, результатом масштабирования оптимизированной лабораторной методики стало создание пилотного производства Тр4, с помощью которого диссертантом было получено 2,5 г целевого пептида.

Во второй части работы Макаровым Д.А. описана разработка региоселективной модификации Т~34 по Х-концевой альфа аминогруппе. Подобраны условия проведения реакций, при которых молекула Тр4 селективно модифицировалась по 1Ч-концевой альфа аминогруппе. В результате проведбнной работы диссертантом были получены конъюгаты Т~34 с полисиаповой кислотой, полнэтиленгликолем и капроновой кислотой. Разработаны методики очистки полученных аналогов. Доказана структура полученных аналогов и показано их пролонгированное действие в сыворотке крови.

В третье части работы Макаровым Д.А. показана принципиально новая технология получения Тр4 с ацетилированием пептида к ию, основанная на интеин-опосредованной экспрессионной системе. Гены Т~34 и сериковой или аланнновой Х-концевых ацетилтрансфераз Е. сой были клонированы в полнцистронную конструкцию под контроль сильного Т7 промотора. В результате экспрессии данной конструкции синтезировались гибридный белок, содержащий Тр4, мини-интеин бугА и хитин связывающий домен, а также сериновая или аланиновая ацетилтрансферазы. В ходе постгрансляционной модификации с Х-конца гибридного белка полностью отщеплялся формилметионин, а М-концевой серии подвергался ацетилироваиию. Были подобраны такие условия культивирования, при которых выход ацетилнрованного пептида достигал 93%. В четвертой части работы исследовалась эффективность полученного рекомбинантного Тр4 на спонтанной мьппиной модели хронического дерматита.

В ходе работы было показано, что местная обработка кожи спины мышей рекомбинантным Тр4 способствовала достоверному ослаблению симптомов хронического дерматита и дала долгосрочный терапевтический эффект в оригинальной спонтанной мьппиной модели дерматита человека. На наи новизна п ве енных весле ованнй и по ченных льтатов Макаровым Д.А впервые разработана эффективная н легко масштабируемая технология получения рекомбинантного Т~34 человека с использованием интеин-опосредованной экспрессионной системы, обеспечивающая селективное высокоэффективное ацетилирование рекомбинантного Тр4 1л ию.

Исследована биологическая активность рекомбинантного Т~34 человека на спонтанной мышиной модели хронического дерматита и показана его эффективность в лечении хронических заболеваний кожи. Синтезированы три аналога рекомбинантного Т~34 человека с улучшенными фармакокинетическими показателями. Разработан эффективный способ очистки аналогов рекомбинантного Т~34 человека с использованием методов ОФ ВЭЖХ.

П оптическая значимость ез льтатов п ченпых нсее тантом. Диссертантом Макаровым Д.А. успешно разработан лабораторный регламент получения рекомбинантного Т~34 человека. В итоге на основе пилотного производства получена опытная партия Тр4 в количестве 2,5 г с фармацевтической чистотой для доклинических исследований.

Главным практически значимым результатом разработанного способа ацетилирования Т~34 гп ию стало уменьшение затрат времени и реактивов на очистку целевого пептида. Ап ба и иеее та ии. Результаты диссертационной работы Макарова Д.А. представлены на различных международных научно-практических конференциях.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях, получено 4 патента. Рекоме ии по п актичееко использованию ез льтатов и выво ов аботы. Данные, полученные диссертантом Макаровым Д.А., могут быть использованы различными разработчиками и производителями фармацевтических субстанций, использующих в своих разработках технологию рекомбинантных ДНК на основе штаммов продуцентов Е. сой. Результаты могут быть использованы при проведении научных исследований в Институте молекулярной генетики РАН, Институте биохимии им. А.Н.

Баха РАН, Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Государственном научноисследовательском институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Замечания. По материалам диссертации можно сделать ряд замечаний: 1. В диссертации в процессе оптимизации лабораторной методики получения ТР4 осаждение балластных белков было осуществлено за счет термической обработки осветленного клеточного лизата.

Однако это не единственный из известных способ осаждения белков. К наиболее часто используемым методам также относятся, например, высаливание или осаждение белков за счбт изменение рН раствора. К сожалению, работа с этими методиками не была проведена, хотя возможно привела бы к более высоким результатам. 2. В главе «Оптимизация и масштабирование стадии очистки дезацетилтимозина бета 4» сложно для понимания описан процесс хроматографической очистки целевого пептнда от остаточных белков.