Диссертация (Разработка методик хроматомасс-спектрометрического определения наркотических средств, психотропных веществ и лекарственных препаратов в биообъектах), страница 11

Температурный режим работы хроматографа представлен втаблице 4.1.3.Таблица 4.1.3 Температурный режим хроматографаСкорость нагрева,Температура,Время выдержки,°С/мин°Смин602501000,5151804102600,5253206Масс-спектрометр работал в режиме ионизации электронным ударом.Детектирование проводили в режиме полного сканирования ионов вдиапазоне 43-600 а.е.м. Энергия ионизации – 70 эВ. Задержка нарастворитель составляла 4 мин. Общее время анализа 1 пробы − 30 мин.На рис. 4.1.1 представлены хроматограмма и масс-спектр производнойТФА-амфетамина в метанольном смыве с волос. Время выхода ТФАпроизводной амфетамина при данных условиях анализа – 7,68 мин.63Рисунок 4.1.1 Хроматограмма и масс-спектр ТФА-производнойамфетамина в метанольном смыве с волос.Для оценки эффективности отмывки каждой из 4х приведенных выше схемв программе обработки инструментальных данных MSD ChemStationE02.00.493 фирмы Agilent Technologies было проведено сравнениехроматограмм последних этапов всех четырех схем, а именно метанольныхсмывов (таб.

4.1.2). Хроматограммы представлены на рис. 4.1.2.AbundanceСмыв 1Смыв 2Смыв 3Смыв 4Рисунок 4.1.2 Хроматограммы четвертых этапов всех предложенных схемотмывки волос от внешних загрязнений.Из рис. 4.1.2 видно, что наиболее чистыми являются хроматограммыпоследних этапов отмывки согласно схемам 1 и 4.64Далее анализировалось содержание искусственного внешнего загрязнителя(амфетамина) между этапами отмывки каждой схемы и проведено сравнениесодержания амфетамина между последними этапами всех схем отмывки. Дляэтого использовалось наложение хроматограмм по характеристическомуиону ТФА-производного амфетамина с m/z = 140 в интервале времени,включающем время выхода ТФА-производного амфетамина. Результатыпредставлены на рис.

4.1.3.а)б)в)г)д)Рисунок 4.1.3 Наложение хроматограмм по выделенному иону с m/z = 140всех этапов отмывки схем 1-4 (а-г соответственно) и последних метанольныхпромывок всех четырех схем (д).Из рис. 4.1.3 (б), (г) и (д) видно, что предложенные в таб.

4.1.2 схемыотмывки волос от посторонних примесей №№ 2, 4 не позволяют полностью65избавиться от искусственного загрязнения, что исключает возможность ихприменения.В результате анализа данных, полученных сравнением чистоты отмывкиволос от внешнего загрязнения можно сделать вывод, что наиболееэффективным и достаточным для дальнейшего проведения химикотоксикологического анализа внутренней области волос является схема № 1, вкоторой волосы последовательно промывают водой с добавлениемдодецилсульфата натрия, метанолом, хлороформом и еще раз метанолом.Для дальнейшей оптимизации условий пробоподготовки волос кинструментальному анализу в качестве модельных образцов былииспользованы волосы людей, не употреблявших наркотические средства,психотропные вещества и лекарственные препараты.

Эти волосы былипредварительно отмыты от посторонних внешних примесей согласно схеме№ 1, представленной в таблице 4.1.2.4.2 Определение условий извлечения экзогенных веществ из матрицыволосСогласно литературным данным [15-20, 27, 35, 36, 37, 41, 46, 48-50, 59,70, 77, 84-86] наиболее быстрый и эффективный способ извлечения веществиз матрицы волос заключается в разрушении структуры волос методомщелочного гидролиза.

Однако данный метод подходит только для веществ,устойчивых в щелочной среде. Так как изучаемые целевые вещества вбольшинстве случаев имеют рКа=≥ 7 и устойчивы в щелочной среде, то онимогут быть извлечены из матрицы волос с помощью щелочного гидролиза.Была проведена серия экспериментов по определениюусловийщелочного гидролиза для выделения целевых веществ (см. табл. 4.1.1) изволос.Так как в литературе [15, 17-20, 26, 37, 41, 46, 48-50, 57, 59, 71, 78, 87 идр.] описано применение растворов щелочей различных концентраций длядеструкции волос, то представлялось интересным провести подбор такойконцентрации, при которой степень извлечения целевых веществ была бымаксимальна. С этой целью использовали растворы гидроксида калия сконцентрациями 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 5,0 N. Эксперимент проводилиследующим образом: в чистые пластиковые пробирки объемом 15 млвзвешивали заранее отмытые от посторонних примесей и потожировыхотделений волосы (см.

п. 4.1), измельченные с помощью шаровой мельницы,в количестве 50 ± 2 мг (по 3 пробы на каждую из приведенных концентрацийщелочи). К взвешенным образцам волос добавляли с помощью шприца66дозатора по 10 мкл метанольных растворов каждого из стандартов целевыхвеществ (см. таб. 4.1.1) с концентрациями 100 мкг/мл и 10 мкл растворавнутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовалиметанольный раствор ДФА с концентрацией 100 мкг/мл. Итоговоесодержание анализируемых веществ составляло ~ 20 нг на 1 мг волос впересчете на массу навески.

К волосам, содержащим стандартыанализируемых веществ и внутренний стандарт, добавляли с помощьюпипеточного дозатора по 2 мл щелочи соответствующей концентрации. Затемих выдерживали в сушильном шкафу в течение 2 часов при температуре40ºС . Далее пробы охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали3 мл метилтретбутилового эфира. Экстракцию проводили на мешалке втечение 20 минут, после чего пробирки с образцами центрифугировали при10 000 об/мин в течение 2 минут. Верхние слои (эфирные) отбирали в чистыеполимерные пробирки и упаривали досуха в токе азота в присутствии100 мкл 0,1% соляной кислоты в метаноле при температуре 40ºС. К сухимостаткам проб добавляли 50 мкл MBTFA и выдерживали в сушильном шкафупри температуре 80°С в течение 30 минут.

Анализ полученных пробпроводили методом ГХ-МС, описанным в п.4.1.По результатам анализа инструментальных данных был произведенрасчет степеней извлечения (α) целевых аналитов из матрицы волос поформуле:SO IS O100 %S N IS N(4.2.1)где SO – площадь пика анализируемого вещества, добавленного к волосам, полученнаяпосле проведения пробоподготовки; ISO – площадь пика внутреннего стандарта,добавленного к волосам, полученная после пробоподготовки; SN – площадь пика чистогоанализируемого вещества в том же количестве, в котором его добавляли к волосам; ISN –площадь пика чистого внутреннего стандарта в том же количестве, в котором егодобавляли к волосам.На рис.

4.2.1.а и 4.2.1.б представлены рассчитанные степени извлеченияисследуемых веществ при различных концентрациях щелочи, используемойдля проведения гидролиза волос.67Степень извлечения, %Метамфетамин ТФААмфетамин ТФА70,00%60,00%МДЕА ТФА50,00%40,00%МДМА ТФА30,00%МДА ТФА20,00%10,00%Фампрофазон0,00%0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 5,0Концентрация щелочи, моль/лСтепень извлечения, %а)100,00%50,00%РСРкарбамазепин0,00%0,51,01,52,02,55,0Концентрация щелочи, моль/ламитриптилинКодеинб)Рисунок 4.2.1 Диаграммы зависимости степеней извлечения от концентрациищелочи для стимуляторов (а), а также анальгетиков, галлюциногенов иантидепрессантов (б).Из рисунка 4.2.1 (а) видно, что для амфетамина, метамфетамина, МДА ифампрофазонамаксимальнаястепеньизвлечениясоответствуетконцентрации гидроксида калия 1,5 моль/л. Для МДЕА и МДМА степеньизвлечения максимальна в случае использования 1,0 N раствора KOH.

Чтокасается анальгетиков, антидепрессантов и галлюциногенов (рис. 4.2.1 (б)),то изменение концентрации щелочи в исследуемом диапазоне не оказываетсущественного влияния на степенях извлечения. Однако для кодеина и68карбамазепина все же наблюдается небольшой максимум при значенииконцентрации КОН − 1,5 моль/л.Оценка зависимости степеней извлечения аналитов от концентрациищелочи, используемой для деструкции структуры волос, показала, что длявсех групп веществ (стимуляторы, анальгетики, галлюциногены иантидепрессанты) оптимальным для проведения гидролиза является раствор1,5 N KOH в воде.Так как в литературе не представлено четких температурных и временныхусловий проведения щелочного гидролиза, то были проведены исследования,направленные на установления наиболее благоприятных температур ивремени для данной процедуры.Для определения оптимальной температуры щелочного гидролизаволос использовали экспериментально подобранный ранее водный раствор1,5 N KOH.