Диссертация (Разработка методик хроматомасс-спектрометрического определения наркотических средств, психотропных веществ и лекарственных препаратов в биообъектах), страница 14

Цель данныхпроцедур - установление способности разработанной методики адекватнорешать поставленную аналитическую задачу. Валидацию разработаннойметодики проводили в три этапа:1. Определение предела детектирования и предела количественнойоценки.2.

Определение линейного участка калибровочной кривой.3. Определение повторяемости с учетом погрешности прибора ипробоподготовки.В качестве целевых аналитов использованы основные представителистимуляторов – амфетамин и МДМА, анальгетиков – кодеин,галлюциногенов − РСР и антидепрессантов – карбамазепин и амитриптилин.834.4.1 Определение предела детектирования и предела количественнойоценкиДля определения предела детектирования методики готовили пакетпроб, состоящий из 5 заранее отмытых от посторонних внешнихзагрязнителей образцов волос людей, не употреблявших анализируемыевещества (в дальнейшем — "бланковых проб").

Каждую из бланковых пробделили на 3 части (соответствующие 3 содержаниям анализируемыхвеществ) массой по 100 мг каждая. Путем добавления к ним стандартныхрастворов аналитов в разных количествах готовили контрольные пробыволос с различными содержаниями целевых аналитов, указанными втаблице 4.4.1.1.Проводили пробоподготовку и анализировали приготовленный пакетконтрольных проб в соответствии с валидируемой методикой. Для каждойхроматограммы, полученной в режиме SIM, отмечали наличие (″+″) илиотсутствие (″-″) пика целевого аналита с отношением сигнал/шум не менее3:1 (см.

таб. 4.4.1.1).Таблица 4.4.1.1 Определение предела детектирования разработаннойметодикиСодержаниеВыявленный сигналНаименование вещества ввеществаволосах(+ обнаружено, - не обнаружено)(нг/мг)0,1++Амфетамин0,5+++++1+++++0,1+++МДМА0,5+++++1+++++0,1++Кодеин0,5++++1+++++0,1+РСР0,5+++++1+++++0,1++Амитриплитин0,5+++++1+++++84Карбамазепин0,10,51++++++++++++Для каждой концентрации по каждому целевому аналиту вычислялиотношение числа положительных результатов к общему числу анализов(количество ″+″ / 5). Концентрация целевого аналита в пробе, при которойвеличина отношения числа положительных результатов к общему числуанализов равняется 1 (100% -ое обнаружение) является пределомдетектирования.Как видно из таблицы 4.4.1.1 предел детектирования для амфетамина,МДМА, РСР и амитриптилина составил 0,5 нг/мг, а для кодеина икарбамазепина – 1,0 нг/мг. Методику можно считать прошедшей проверкуначувствительностьобнаружениявещества,посколькупределдетектирования не превысил 1 нг/мг.Предел количественной оценки рассчитывали путем умножениявеличины предела детектирования на 10, что составляет 5 нг/мг дляамфетамина, МДМА, РСР и амитриптилина, а также 10 нг/мг – для кодеина икарбамазепина.4.4.2 Определение линейного участка калибровочной кривойГотовился набор проб, состоящий из 6 бланковых образцов волосодного человека, не употреблявшего анализируемых веществ, в которыебыли внесены целевые вещества в различном количестве и растворвнутреннего стандарта (ДФА) в количестве 1 мкг/мг.

Итоговое содержаниеанализируемых веществ в волосах представлено в таблице 4.4.2.1.Приготовленные пробы исследовались по валидируемой методике три раза.После трехкратного проведения анализа каждой пробы вычислялисреднее отношение площади пика аналита к площади пика внутреннегостандарта и строили зависимость этих отношений от исходного содержанияанализируемого вещества в волосах, т.е. калибровочную кривую (см. рис.4.4.2.1).85Таблица 4.4.2.1 Содержание аналитов в волосах для построениякалибровочных графиков№ пробыСодержаниеаналитов в волосах,нг/мг0,51,05,010,050,0100,0123456а)б)86в)г)д)87е)Рисунок 4.4.2.1 Калибровочные кривые по амфетамину (а), МДМА (б),кодеину (в), РСР (г), карбамазепину (д) и амитриптилину (е).Для каждого графика определяли линейный участок кривой ипроводили линию тренда.

Для всех анализируемых веществ выводилиуравнение полученной прямой и рассчитывали коэффициенты корреляции.В результате анализа графических зависимостей отношений площадейпиков аналитов и внутреннего стандарта от исходного содержанияанализируемого вещества в волосах установлено, что калибровочная криваялинейна во всем диапазоне исследуемых содержаний веществ в волосах икоэффициенты корреляции для всех исследуемых соединений составили0,99.4.4.3 Определение расширенной повторяемости с учетомпробоподготовкиГотовился набор из 3 бланковых проб волос разных людей, в которыевносили целевые аналитыи внутренний стандарт (ДФА) в такихколичествах, чтобы их содержание в волосах составляло 10 нг/мг.Проводили пробоподготовку и 10-кратный анализ данного набора из 3хпроб по разработанной методике.Определяли площади пиков целевых аналитов и внутреннего стандартав пробах.

Для каждого из анализируемых веществ по всем 30 измерениямрассчитывали отношение площади пика аналита к площади пика внутреннегостандарта и среднеквадратическое отклонение (далее – СКО) для этихотношений. Расчет СКО осуществляли по формуле:88(4.4.3.1)где Sc – среднеквадратичное отклонение соотношения площадей пиков аналита ивнутреннего стандарта, используемое для оценки повторяемости метода; ci – отношениеплощадей пиков вещества и внутреннего стандарта, полученное при одиночномизмерении; cmсреднее отношение площадей пика целевого аналита и внутреннегостандарта по 30 пробам, n – количество проб.За расширенную повторяемость методики с учетом пробоподготовкидля каждого аналита принимали отношение СКО, рассчитанного по формуле4.4.3.1, к среднему значению площади пика целевого вещества по 30типроведенным измерениям, выраженное в процентах.

Расчет расширеннойповторяемости производили по формуле:(4.4.3.2)где St – среднеквадратичное отклонение для оценки расширенной повторяемости сучетом пробоподготовки; cmсреднее отношение площадей пика целевого аналита ивнутреннего стандарта по 30 пробам.В таблице 4.4.3.1 представлены рассчитанные для всех целевыханалитов значения Сm, Sc и.

Следует отметить, что чем значение Stменьше, тем повторяемость методики лучше. Как видно из табл. 2.5.3.1 длявсех анализируемых веществ значения расширенной повторяемости непревышают 26%.Таблица 4.4.3.1 Данные по расширенной повторяемости методикиНазваниеСодержание,Сm, ед.Sc , ед.,%веществанг/мгАмфетамин106.591.2218.54МДМА1013.242.5719.41Кодеин100.280.0515.96РСР105.580.9416.94Амитриптилин1017.073.0818.04Карбамазепин100.120.0325.87По результатам проведенной процедуры валидации методики химическойидентификациистимуляторов,анальгетиков,галлюциногеновиантидепрессантов в волосах методом газовой хроматографии с применениеммасс-селективного детектирования можно сделать следующие выводы:предел детектирования методики для всех классов веществсоставляет 1 нг/мг;89предел количественного определения методики – 10 нг/мг;рабочий диапазон методики 0,5 – 100 нг/мг;значения расширенной повторяемости не превышают 25%;разработанная методика удовлетворяет требованиям ГОСТР 8.563-2009.Разработанная методика успешно применяется в экспертной практикеИнститута криминалистики Центра специальной техники ФСБ России.Общее время, которое требуется на анализ одной пробы волос по даннойметодике, значительно меньше времен, представленных в литературе [50, 53,56, 60, 64, 70, 72, 73, 75,141] и составляет 5 часов.4.5 Разработка методики подтверждающего анализа при определениистимуляторов и галлюциногенов в волосах методом ВЭЖХ-МС/МСАльтернативным ГХ-МС инструментальным методом анализа являетсяВЭЖХ-МС/МС.

Данный метод обладает более высокой чувствительностью испецифичностью. Поэтому пределы количественного определенияразработанной методики химической идентификации стимуляторов,анальгетиков, галлюциногенов и антидепрессантов в волосах методом ГХМС могут быть снижены путем использования ВЭЖХ-МС/МС. Такимобразом,можнополучитьвысокочувствительныеметодикиподтверждающего анализа ксенобиотиков в волосах.В этих целях была разработана методика подтверждающего анализастимуляторов (амфетамин, метамфетамин, МДА, МДМА, МДЕА) игаллюциногенов (РСР) методом ВЭЖХ-МС/МС.Определение условий подготовки волос к анализу проводили путемоценки данных, полученных в п.

4.2. Так для стимуляторов игаллюциногенов наиболее оптимальные условия щелочного гидролиза –выдержка в 1 N растворе KOH в воде при температуре 60ºС в течение часа.Экстракцию целевых веществ лучше проводить метилтретбутиловым эфиромс последующим упариванием в присутствии 1 % раствора соляной кислоты вметаноле. Сухие остатки целесообразно растворять в метаноле дляпоследующего инструментального анализа. Применение ВЭЖХ-МС/МСтакже позволяет исключить из пробоподготовки волос стадиюдериватизации, что заметно снижает общее время анализа проб.Для проведения исследований использовали высокоэффективныйжидкостной хроматограф Accela с тройным квадрупольным массанализатором TSQ Quantum Access MAX фирмы Thermo Scientific (США).Хроматографирование проводили в градиентном режиме на колонке Hypersil90Gold C-18 длиной 50 мм, внутренним диаметром 4,6 мм и размером частицсорбента 1,9 мкм.

В качестве подвижной фазы использовали смесь 0,1 %раствора муравьиной кислоты в метаноле (компонент А) и 0,1 % растворамуравьиной кислоты в деионизированной воде (компонент Б). Составподвижной фазы изменяли следующим образом: начальное содержаниекомпонента А – 5 % с последующим его повышением до 100% квосемнадцатой минуте и поддержанием данного соотношения компонентовдо двадцать третьей минуты. Скорость потока подвижной фазы –150 мкл/мин. Температура термостата колонки − 40ºС.Детектирование проводили в режиме мониторинга единичных реакций(SRM).

Полярность детектируемых ионов – положительная.Методионизации – электрораспыление. Использовали следующие настройки массанализатора: напряжение на капилляре – 3500 В, давление газа-распылителя– 30 psi, давление вспомогательного газа – 5 psi, время сканирования –0,010 с, количество микросканов − 15.Выбор условий детектирования, обеспечивающих максимальнуючувствительность, проводили в несколько этапов.