Диссертация (Разработка методик хроматомасс-спектрометрического определения наркотических средств, психотропных веществ и лекарственных препаратов в биообъектах), страница 13

Экстракцию проводили на мешалке втечение 20 минут, после чего пробирки с образцами центрифугировали при10 000 об/мин в течение 2 минут. Органические слои отбирали в чистыеполимерные пробирки и упаривали досуха в токе азота в присутствии100 мкл 0,1 % соляной кислоты в метаноле при температуре не выше 40ºС. Ксухим остаткам проб добавляли 50 мкл MBTFA и выдерживали в сушильномшкафу при температуре 80°С в течение 30 минут.

Анализ полученных пробпроводили методом ГХ-МС, описанным в п.4.1.Расчетные данные степеней выхода целевых аналитов при использовании вкачестве органических экстрагентов различные соотношения (v:v) гексан :этилацетат представлены в таблице 4.2.2.75Таблица 4.2.2 Степени выхода целевых аналитовСоотношениегексан:этилацетат1:12:13:14:15:11:215,6 %38,4 %26,8 %45,1 %42,8 %27,4 %14,3 %31,9 %24,8 %33,2 %38,9 %29,8 %25,1 %51,0 %45,2 %58,7 %47,4 %37,4 %13,0 %11,0 %29,1 %44,6 %38,1 %52,9 %13,2 %26, 4%12,8 %28,9 %21,3 %42,7 %НазваниевеществаАмфетамин ТФАМетамфетамин ТФАМДА ТФАМДМА ТФАМДЕА ТФАФампрофазонКодеинPCPАмитриптилинКарбамазепинСтимуляторы27,8 % 78,4 % 25,6 %50,4 % 46,5 % 51,3 %49,6 % 32,9 % 46,3 %55,3 % 54,4 % 59,2 %31,6 % 14,4 % 47,6 %35,9 % 31,3 % 35,2 %Анальгетики18,5 % 58,1 % 32,9 %Галлюциногены61,8 % 63,5 % 52,3 %Антидепрессанты22,4 % 26,2 % 23,1 %44,7 % 61,4 % 46,2 %Из таблицы 4.2.2 видно, что для амфетамина, кодеина, РСР,амитриптилина и карбамазепина максимальная степень извлечения быладостигнута для соотношения гексан : этилацетат 2:1.

Влияние изменениясоотношения данных органических растворителей незначительно сказалосьна степени извлечения фампрофазона. Уменьшение объемной долиэтилацетата в смеси экстрагентов привело к явному снижению α дляамитриптилина, МДА, МДМА и кодеина, что, вероятно, связано суменьшением полярности экстрагента вследствие уменьшения долиполярного растворителя в смеси. Увеличение же объемной доли этилацетат вэкстракционной смеси привело как к увеличению степеней извлеченияметамфетамина, МДМА, МДЕА и карбамазепина, так и к загрязнениюхроматограмм экстрактов пиками мешающих компонентов (см.

рис. 4.2.5). Врезультате анализа данных представленных в табл. 4.2.2 и на рис. 4.2.5можно сделать вывод, что для проведения скриннингового анализа волос наналичие стимуляторов, анальгетиков, галлюциногенов и антидепрессантовцелесообразно использовать в качестве экстрагентов ЖЖЭ смесь гексан :этилацетат в объемном соотношении 2:1 соответственно.76Рисунок 4.2.5 Хроматограммы экстрактов модельных образцов волос сиспользованием различных объемных соотношений гексан:этилацетат вкачестве экстрагентов.Следующим после очистки экстрактов этапом пробоподготовки волос канализу является, в случае использования ГХ-МС в качествеинструментального метода, дериватизация.Выбор дериватизирующего реактива и условий дериватизации былипроизведены на основе анализа литературный данных и структурныхособенностей анализируемых соединений и описаны выше.4.3 Исследование условий инструментального анализаВ качестве инструментального метода для скриннингового анализа волосвыбрана газовая хроматография с одноквадрупольным масс-детектором, т.к.данный метод широко используется при проведении криминалистическихэкспертиз объектов биологического происхождения.

В литературных данныхтакже освещено использование данного метода для определения в волосахразличных экзогенных соединений [15, 19, 24, 25, 27, 29, 36, 45, 50 и др.].В п. 4.1. подробно описаны подобранные параметры хроматографическогоразделения целевых аналитов (см. таб. 4.1.1) и матрицы волос. Выбороптимальных параметров этого метода основывался на физико-химическихсвойствах (таб. 4.1.1.) анализируемых веществ.

В таблице 4.3.1 представленыосновные свойства аналитов, полученные в результате проведенныхисследований.77Таблица 4.3.1 Свойства анализируемых веществСвойстваНазваниевеществаАмфетамин ТФАМетамфетамин ТФАМДА ТФАМДМА ТФАМДЕА ТФАМДПВМефедрон ТФАФампрофазонСтрихнинКодеинМорфин 2ТФАФентанилМетадонPCPАмитриптилинКарбамазепин*ТемператуВремяБруттора выходавыхода*,*формула с колонки ,минºССтимуляторыC11H12F3NO231.211627,69C12H14F3NO245.241809,15179.22 C12H12F3NO322212,69289.25 C13H14F3NO323215,05303.28 C14H16F3NO323515,42C16H21NO3275.1526120,51273.10 C13H14F3NO218011,16C24H31N3O377.5232026,54C21H22N2O2334.1732024,81АнальгетикиC18H21NO3299.3630023,55477,10 C21H17F6NO526321,16C22H28N2O336.4732025,20CHNO309.2125820,2421 27ГаллюциногеныC17H25N243.3925617,14АнтидепрессантыC20H23N277.4028221,14C15H12N2O236.2725819,58МолекулярнаямассаОсновныеионы140, 118154, 118162, 135154, 162168, 162126, 127204, 119286, 229334, 167299, 229364, 477245, 18972, 294242, 20058, 202193, 165параметры, полученные экспериментальны путемДля наилучшего разделения целевых аналитов ГХ-МС методом былпредложен температурный градиент, представленный на рисунке 4.3.1.Рисунок 4.3.1 График температурного градиента термостата ГХ-МСметода анализа исследуемых веществ (таб.

4.1.1) в волосах.78Из рис. 4.3.1 видно, что на данной зависимости имеется пять плато. Первоеплато предназначено для обеспечения адсорбционного взаимодействиявеществ с фазой колонки. На втором плато происходит смывание схроматографической колонки органических растворителей.

Некоторые изанализируемых веществ имеют близкие температуры выхода с колонки, чтозатрудняет их разделение. Так температуры выхода с колонки стимуляторовамфетаминового ряда близки (~160-200ºС), поэтому для их надежногоразделения введено дополнительное плато продолжительностью 4 мин притемпературе 180ºС. МДПВ, морфин 2ТФА, метадон, РСР и карбамазепинимеют температуры выхода с колонки ~ 260ºС, поэтому при этойтемпературе также введено плато продолжительностью 0,5 мин. Последнееплато (320ºС − 6 мин) используется для удаления с хроматографическойколонки труднолетучих компонентов матрицы волос, а также для разделениявеществ, выходящих при данной температуре.Следует отметить, при использовании данного температурного градиентапроисходит не только хорошее разделение целевых аналитов, но и нетребуется дополнительной очистки колонки после проведения анализа.

Изэтого следует, что разработанный метод хроматографического разделенияисследуемых веществ пригоден для поточного анализа большого количествапроб волос.Времена удерживания аналитов на колонке зависят от множествапараметров хроматографической системы: физико-химические свойствавеществ, длина колонки, скорость потока газа-носителя и т.д. Так как длинаколонки периодически меняется в ходе проведения техническогообслуживания (далее – ТО) хроматографа, что приводит к изменению временудерживания веществ. Корректировка времен удерживания может бытьпроведена за счет варьирования скорости потока газа-носителя черезколонку. Проведены исследования, направленные на определение условийкорректировки времен удерживания после проведения очередного ТО. Дляэтого изучена зависимость изменения времени выхода внутреннего стандарта(ДФА) от скорости потока газа-носителя.

Полученные экспериментальныеданные представлены в таблице 4.3.2.79Таблица 4.3.2 Экспериментальные данные по определению зависимостивремени удерживания ДФА от скорости газа-носителяПоток,мл/мин1,01,11,261,31,4Время выходаДФА, мин11,41211,44611,45211,39011,39111,38711,14311,13911,15311,07111,07011,06710,90610,90210,899Tср, мин∆Т, минRSD, %11,4370,016440,14411,3890,001550,01411,1450,005330,04811,0690,001550,01410,9020,002440,022На основании представленных в таблице 4.3.2 данных построеназависимость времени выхода ДФА от скорости потока газа-носителя (рис.4.3.2)суказаниемотносительныхпогрешностейполученныхэкспериментальных данных (RSD).

Полученное уравнение линии трендаy=−1.3752x+12.855 с относительным квадратичным отклонением R2 =0,973было использовано для корректировки значений времен выхода целевыханалитов после проведения ТО прибора.80Рисунок 4.3.2 Зависимость времени выхода ДФА от скорости потока газаносителя для разработанного метода.Корректировку времен выхода проводили следующим образом. Послепроведения очередного ТО, связанного с изменением длины колонки, вразработанном методе анализировали метанольный раствор стандарта ДФА сконцентрацией 5 мкг/мл и определяли его время выхода (y2). Далее с учетомвремени выхода ДФА при скорости потока (y1 и x1 соответственно),установленной в ГХ-МС методе до проведения ТО, проводили расчет новойскорости потока (x2) по формуле 2.3.1:(4.3.1)где y1 и y2 – временя выхода ДФА, а x1 и x2 – скорости потока газаносителя.Расчетную скорость потока записывали в метод и заново анализировалиметанольный раствора ДФА.

В результате проведенных манипуляцийвремена выхода ДФА до и после проведения ТО отличались не более чемна 1 %.В ходе оптимизации условий пробоподготовки масс-спектрометра работалв режиме полного сканирования всех ионов (Scan, см. п. 4.1). Для увеличениячувствительности по целевым аналитам (табл. 4.1.1) разработан метод ГХМС анализа с работой масс-спектрометра в режиме селективного81мониторинга ионов (SIM). Хроматографические параметры SIM методасоответствуют параметрам Scan метода, описанного в п. 4.1. Параметрысканирования SIM метода представлены в таблице 4.3.3.Таблица 4.3.3 Параметры настройки масс-спектрометра в режиме SIM№ сегмента1234567Время началаАнализируемое всканирования, сегменте веществомин7.00Амфетамин ТФА,Метамфетамин ТФА10.50Мефедрон ТФА,ДФА,МДА ТФА13.00МДМА ТФА,МДЕА ТФА16.00PCP19.00МДПВ,Морфин 2ТФА,Метадон,Карбамазепин,Амитриптилин21.55Кодеин24.00Фампрофазон,Стрихнин,ФентанилСканируемыеионы139.9, 118.1, 91.0,153.9, 118.0, 109.9119.0, 77.1, 147.0,169.1, 168.0, 167.0,134.9, 162.0, 274.9154.0, 162.0, 134.9,168.0, 162.0, 139.9200.1, 242.1, 186.1126.0, 127.0, 96.0,364.1, 477.0,72.0, 223.0, 294.0,192.9, 236.0, 164.9,58.0, 202.0, 215.0299.1, 229.1, 282.0286.1, 229.1, 287.1,334.0, 335.0, 162.0,245.1, 188.9, 146.0Использование ГХ-МС метода с работой масс-спектрометра в режиме SIMпозволило не только повысить чувствительность методики анализа волос наналичие целевых соединений, но и привело к получению более чистыххроматограмм (см.

рис. 4.3.3)82абРисунок 4.3.3 Хроматограммы образцов волос, содержащих амфетамин,метамфетамин, МДЕА, РСР и метадон, полученные в режимах Scan (а) иSIM (б).В результате проведенных исследований создана методика химическойидентификациистимуляторов,анальгетиков,галлюциногеновиантидепрессантов (см. табл. 4.1.1) в волосах методом газовой хроматографиис применением масс-селективного детектирования.4.4 Валидация методики химической идентификации стимуляторов,анальгетиков, галлюциногенов и антидепрессантов в волосах методомгазовой хроматографии с применением масс-селективногодетектированияВажным завершающим этапом при разработке любой методикиизмерения является ее валидация и (или) верификация.