Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля), страница 5

arginine vasopressin)–гипоталамический гормон, играющий ключевуюроль в гомеостазе, регуляции водного, углеводного и солевого обменов ворганизме.Вазопрессинпредставляетсобойпептид,состоящийиз9аминокислотных остатков и имеющий одну внутримолекулярною дисульфиднуюсвязь, образованную двумя аминокислотными остатками цистеина Cys 1―Cys6(Рисунок 4). Период полураспада вазопрессина составляет 10-35 мин: соединение22подвергается стремительному протеолитическому расщеплению трипсином вположении Arg8―Gly9NH2, а затем по положениям Pro7―Arg8 и Cys6―Pro7 подвоздействием карбоксипептидаз [59].

Десмопрессин (1-desamino-8-D-argininevasopressin, одно из торговых названий DDAVP) представляет собой один изаналогов вазопрессина, в структуре которого N-концевой аминокислотныйостаток Cys1 дезаминирован, Arg в положении 8 заменен на D-изомер. ВведениеD-аминокислоты значительно увеличивает период полураспада десмопрессина вчеловеческом организме и составляет более 3 ч. Как показано в экспериментеin vitro с желудочным соком и гомогенатом слизистой оболочкой кишечниказамещение, L-Arg8 на D-Arg8 в сайте расщепления трипсином позволяетзначительно увеличить стабильность соединения [60]. В работе Fjellestad-Paulsenи Lundin при инкубации с гомогенатами печени и почек крыс показано, что 70%вазопрессина инактивируется в течение 30 мин, в то время как деградациядесмопрессина происходит значительно медленнее [61].вазопрессиндезаминоглицинвазопрессин1 ―2 ―3―4―5—6—7—1 ―2 ―3―4―5—6—7—1 ―2 ―3―4―5—6—7—метаболитметаболит4―5—6——5—6—98—Cys ― Tyr ― Phe ― Gln ― Asn — Cys — Pro — ArgкарбоксипептидазаCys ― Tyr ― Phe ― Gln ― Asn — Cys — ProаминопептидазаP8—Cys ― Tyr ― Phe ― Gln ― Asn — Cys — Pro — Arg— Gly-NH2карбоксипептидазаметаболитP-Proтрипсин1 ―2 ―3―Cys ― Tyr ― Phe ― Gln ― Asn — Cys—химотрипсиндесмопрессин1 ―2 ―3―4―7—8—9Mpa ― Tyr ― Phe ― Gln ― Asn — Cys — Pro — (D-Arg) — Gly-NH2химотрипсинРисунок 4 — Схематическое изображение структур вазопрессина идесмопрессина с указанием потенциальных сайтов расщепления молекулпротеолитическими ферментами [59,62]23Пептиды, в состав которых входят D-аминокислоты, получили название Dпептидов.

В качестве примера можно привести терапевтический препарат длялечения сердечной аритмии Ротигаптид (Rotigaptide®, ZP-123), который внастоящее время проходит стадию клинических исследований [63]. При изученииего фармакодинамических свойств с участием животных показано, что ~93%гексапептида выводится с мочой из организма в неизмененном виде. Приинкубации Ротигаптида in vitro с микросомальной фракцией печени и гепатоцитовмышей, крыс, собак и человека метаболитов детектировано не было [64,65].Все без исключения представители класса GHRP включают D-изомерыаминокислот, которые защищают пептиды от воздействия эндо- и экзопептидаз. Вчастности, GHRP-1 и алексаморелин подвержены более быстрой деградации ввиду незащищенной пептидной связи в первом положении D- или синтетическойаминокислотой, что было показано в работе [6].ЗаменаприроднойL-аминокислотынаD-изомерможетснижатьстабильность соединения, как это показано для аналогов GHRH (1-29) идерморфина[66,67].Данныепримерыуказываютнанеобходимостьиндивидуального подхода к дизайну каждого разрабатываемого соединения сучетом его структурных особенностей и принципов взаимодействия [41].1.5.1.3 Замена на β-аминокислотыПо структуре β-аминокислоты очень похожи на α-аминокислоты и лишьотличаются дополнительным атомом углерода между амино- и карбокситерминальными атомами основной углеродной цепи у β-аминокислот.По сравнению с протеиногенными α-аминокислотами, β-аминокислотыотносительно редки, поэтому часто не узнаются пептидазами, а структурноесходство делает их включение в пептидную последовательность привлекательнымдляувеличениясинтетическиестабильностианалогипептидовангиотензина IIибелков[68].Показано,(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)чтосзамененными N-концевыми остатками Asp1 на β-D-Asp и β-L-Asp обладалибольшей физиологической активностью в экспериментах с крысами и более24длительным эффектом действия, возможно, ввиду их полной устойчивости клейциновой аминопептидазе.

В то же время при замене Phe8 соответствующей βаминокислотой происходило снижение активности. Повышенная ферментативнаястабильность in vitro к химотрипсину и к ангиотензин-конвертирующемуферменту отмечена среди аналогов ангиотензина II с β-аминокислотами вположениях 4, 5 (β-Tyr4 и β-Ile5) и аналогов брадикинина (Arg-Pro-Pro-Gly-PheSer-Pro-Phe-Arg)сзамененнымиаминокислотамиβ-Pro7иβ-Phe8,соответственно [69].В 1996 году впервые описан β-пептид, состоящий только из βаминокислотных остатков.

В работе [70] показано, что изотопно-меченный βнонапептид почти не метаболизируется in vivo в организме крыс и не деградируетin vitro при инкубации с различными крысиными гомогенатами тканей.Вторичная структура β-пептидов может сильно отличаться от природных αпептидов, поэтому на фармакокинетических характеристиках β-пептидов в рамкахданного литературного обзора останавливаться более подробно не будем.1.5.1.4 Замена на искусственные аминокислотыОдним из перспективных направлений белковой инженерии для увеличенияпротеолитической стабильности белков и пептидов является использованиесинтетических(такжечастоназываемых«непротеиногенных»,или«ненатуральных») аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом. Внастоящее время существуют сотни коммерчески доступных, структурноразличающихся неприродных аминокислот, которые пригодны для синтезапептидов [71].

Синтетические аминокислоты такие, как β-нафтилаланин,аминоизобутиловая и меркаптопропионовая кислоты входят в структурубольшинства известных представителей класса GHRP.Одним из примеров использования синтетических аминокислот являютсяаналогигонадолиберина.Декапептидгонадолиберин(GnRH,отангл.gonadotropin-releasing hormone, или LHRH, от англ. luteinizing hormone–releasinghormone, или FSH-RH, от англ.

follicle-stimulating hormone–releasing hormone)25представляет собой гипофизарный гормон, отвечающий за регуляцию синтеза исекреции фолликул-стимулирующего гормона и лютеинизирующего гормона.Период полураспада природного гонадолиберина составляет 2-4 мин из-забыстрого протеолитического расщепления пептидазами [72]. Для увеличениястабильности молекулы и повышения биологической активности за последние25 лет разработано более 3000 аналогов GnRH, большинство которых содержатненатуральные аминокислоты [73]. При изучении стабильности гонадолиберинови его аналогов показано, что основными ферментами деградации являютсяангиотензин-конвертирующий фермент (ACE, от англ. Angiotensin-convertingenzyme, EC 3.4.15.1) и металлоэндопептидазы (EС 3.4.24.15, EС 3.4.24.11).Основными сайтами расщепления гонадолиберина являются пептидные связиTrp3―Ser4 и Tyr5―Gly6 [74], поэтому, как правило, аналоги содержатаминокислотнуюзаменувположении6,чтозначительноувеличиваетстабильность молекулы (Рисунок 5).Гонадолиберин2 ―1τ1/2, мин3―4―5—7—68—910Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr — Gly — Leu — Arg— Pro — Gly-NH23-4Госерелин2 ―3―4―5—2 ―3―4―5—2 ―3―4―5—17—68—910Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr — D-Ser(tBu) — Leu — Arg — Pro — azaGly-NH2138-252Нафарелин17—68—9108—9Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr — (D-Nal) — Leu — Arg— Pro — Gly-NH2156-240Гистрелин16710Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr — D-His(ImBzl) — Leu — Arg— Pro — Gly-NH2240Бусерелин12 ―3―4―5—6—7—8—910Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr — D-Ser(tBu) — Leu — Arg— Pro — Gly-NHC2H572-80Рисунок 5 — Структуры аналогов гонадолиберинов и их периоды полураспада[75,76].

Зеленым цветом выделены сайты замены Gly6 в интактной молекулегонадолиберина на ненатуральные аминокислоты. Госерелин и бусерелин такжеимеют структурные модификации azaGly (объяснение приведено ниже) иацилирование С-концевой амидогруппы, соответственно [64]26В настоящее время госерелин (торговое название Zoladex®, AstraZeneca) игистрелин (торговое названия Vantas® и Supprelin® LA) являются наиболеераспространенными из представленных выше аналогов гонадолиберинов [76].Согласноданнымфармакодинамическихисследований,послеприемадобровольцами около 27% препарата госерелина связывается с белками плазмы ворганизме человека [77]. Основным направлением его метаболизма является Сконцевой гидролиз с образованием метаболитов: циркулирующего в кровифрагмента госерелина (1-7) и фрагмента (5-10)–в моче.

Препарат быстровыводится почками и печенью. Согласно справочной информации к препаратуУправления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов имедикаментов США (FDA, от англ. US Food and Drug Administration), около 90%изотопномеченного госерелина экскретировалось с мочой, 20% из них–внеизмененном виде.Согласно данным FDA, около 70% гистрелина связывается с белкамиплазмы крови [78].

Циркулирующих метаболитов идентифицировано не было, новвиду его структурной схожести с другими аналогами гонадолибериноввозможными метаболитами могут быть продукты протеолитической деградациипопептиднымсвязямидеалкилированияврезультатепеченочногомикросомального метаболизма, как это было показано in vitro.Другой аналог гонадолиберина дегареликс (название бренда Firmagon®)представляет собой устойчивый линейный декапептид, в состав которого входят 7протеиногенных аминокислот, пять из которых являются D-стереоизомерами.Около 90% вещества связывается с белками плазмы крови, метаболизмхарактеризуется С-концевым протеолитическим направлением.