Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля), страница 4

Кроме того, амидированиев природе имеет функциональное значение и встречается в структуре различныхгормонов. Тем не менее, при пероральном приеме биодоступнось GHRP непревышает 1%, что послужило толчком к разработке низкомолекулярныханалогов СГР непептидной природы [36].Первым аналогом непептидной природы стал L-692,429, синтезированный в1992 году на основе бензолактамов.

Многие из разработанных секретагогов внастоящее время находятся на финальных стадиях клинических исследований:CP-424,391 (в регистре аптечных препаратов - Капроморелин, Pfizer), RM-131,BIM-28131,BIM-28163(Реламорелин,RhythmPharmaceuticals),MK-677(Ибутаморен), ONO-7643, RC-1291, ST-1291 (Анаморелин, Helsinn Therapeutics) иSM-130,686.

Однако ввиду их непептидной природы более подробно на нихостанавливаться не будем.В литературных источниках [27,30,38] описаны два механизма передачисигнала при связывании молекулы СГР с рецептором GHS-Ra1: основной(фосфолипаза С/инозитол-3-фосфатныйсигнальныйкаскад)иминорный(протеинканаза А/циклический аденозинмонофосфат сигнальный путь). Приактивации основного пути после связывания молекулы агониста с G-белок–связанным рецептором, происходит активация рецептора с последующеймиграциейGαq/11-субъединицыG-белка,котораязатемактивируетмембраносвязанный фермент фосфалипазу С.

Активированная фосфалипаза Синдуцируетрасщеплениефосфоинозитол-4'5'-бифосфата(PIP2,отангл.phosphatidylinositol 4,5-biphosphate) на инозитол-3-фосфат (IP3, от англ. inositol1,4,5-trisphosphate) и диацилглицерин (ДАГ). Образовавшийся IP3 индуцирует17высвобождение ионов Ca2+ из IP3-чувствительных внутриклеточных депо кальция,тем самым происходит начальная деполяризация клетки.

Молекулы ДАГактивируют протеинкиназу С, которая ингибирует мембранные K+-каналы, чтоведет к возрастанию внутриклеточного потенциала. При деполяризации клеткиоткрываются потенциал-зависимые Ca2+-каналы, что влечет внеклеточный притоккальция и последующее высвобождение ГР из секреторных гранул. На Рисунке 2схематично представлены оба механизма регуляции секреции ГР через GHS-Ra1 ирецептор GHRH [5].мозгсоматостатинподжелудочнаяжелезагипоталамусGHRPGHRHгрелингипофиз[Ca2+]↑[цАМФ]↑костиГРмышцыжелудокИФР-1печеньжироваятканьдругиетканиРисунок 2 — Схематичное изображение механизма регуляции секреции ГР [5]В экспериментах in vitro показано, что GHRP-2 дозо-зависимо повышаетуровень циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в соматотрофах овец истимулируетсекрециюГР,какэтопроисходитприактивацииаденилатциклазного сигнального пути при связывании GHRH со своимрецептором[27].Однакоподобный18эффектнепоказанвкрысиныхсоматотрофныхклетках,чтоставитподвопроссуществованиеи/илиуниверсальность для всех биологических видов альтернативного сигнальногопути с активацией протеинкиназы А и участием цАМФ в качестве вторичногомедиатора [3,27].На фоне развивающегося рынка непептидных стимуляторов ГР пептидныесекретагогипривлекательнывследствиераспространенногомненияоминимальных побочных эффектах и неуловимости ввиду их быстрой деградациив человеческом организме после приема [41].

Одним из стандартных подходовустановления злоупотребления запрещенных препаратов является определение вбиожидкостях спортсмена метаболитов и/или маркеров их приема. Однакоисследования метаболизма биоактивных пептидных соединений интересны нетольковцеляхантидопинговогоконтроляилисточкизренияфармакокинетических и фармакодинамических свойств, но и с точки зрениябиологического действия образующихся их метаболитов, которые могут бытьболее активными, или даже реактивными и вызывать активный иммунный ответ[42]. Таким образом, белки и пептиды могут включать различные природные исинтетические модификации, поэтому ниже будут рассмотрены основныемодификации, применяемые для улучшения фармакодинамических свойств, иособенности метаболизма соединений пептидной природы.1.2 Особенности метаболизмасинтетических белков и пептидовхимически-модифицированныхиСредние по размеру пептиды обладают уникальными возможностями дляих применения в фармакологической индустрии: высокой аффинностьюсвязывания с терапевтическими мишенями, большей простотой в пониманиихарактера механизма действия, превосходной специфичностью к мишеням,низкими токсичностью и иммуногенностью, минимальным потенциальнымриском при совместном приеме лекарств и так далее.

В настоящее время белки ипептиды занимают только ~ 2% от всего рынка лекарств, но темпы развития вданном сегменте сулят лекарственным препаратам пептидной природы большуюнишу [41].19Пептиды обладают низкой проницаемостью через клеточную мембрану,низкойбиодоступностьюприпероральномприемеипротеолитическойнестабильностью, что обуславливает короткий период их полураспада [41].

Дляулучшения их фармакокинетических свойств в настоящее время используютсяразличные модификации отдельных аминокислотных остатков, пептидных связейили структуры всей молекулы, о чем более подробно будет изложено ниже.1.2.1 Замена аминокислот (использование D-, β- и ненатуральныхаминокислот)Разныепротеазыхарактеризуютсяразличнойферментативнойспецифичностью, для обозначения которой используется номенклатура Schechterи Berger [43]. Согласно данной номенклатуре, аминокислотные остаткирасщепляемого пептида обозначаются Р1, Р2, Рn и Р1', Р2', Рn' в зависимости от Nили С- концевого расположения аминокислоты относительно сайта расщепленияс увеличением порядкового номера от места разрыва полипептидной цепи(Рисунок 3).субстратсайт расщепленияPn- - - - - - - P4 ― P3 ― P2 ― P1 ―││ P1' — P2' — P3'— P4' - - - - - - - Pm'││││││││S4 ― S3 ― S2 ― S1 ― S1' — S2' — S3'— S4'││││││││протеазаРисунок 3 — Схематическое изобажение сайта расщепления протеазами.

ПозицииР1-Рn, P1'-Pm' и S4-S1, S1'-S4' обозначают аминокислотные остатки субстрата (Р) ифермента (S) относительно расщепляемой пептидной связи (||) [43]Одним из подходов увеличения протеолитической стабильности пептидноймолекулы является замена аминокислотного остатка в сайте узнаванияпротеолитическогоферментадругойсинтетической [44].20аминокислотой:природнойили1.2.1.1 Замена аминокислот в потенциальных сайтах расщепления протеазЗамена аминокислотного остатка другой природной кислотой в сайтеузнавания протеолитического фермента использована при разработке аналоговглюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1, от англ. GLP-1, Glucagon-like peptide-1) иGHRH.ГПП-1 и GHRH стремительно инактивируются в плазме крови вэкспериментах in vivo и in vitro под воздействием высокоспецифичного ферментадипептидилпептидазы-4 (от англ.

DPP IV - Dipeptidyl peptidase IV, EC 3.4.21.26) вположенияхAla2―Glu3иAla2―Asp3,соответственно[31,32].Заменааминокислотного остатка Ala на Gly во втором положении в последовательностисинтетическогоаналогаГПП-1экзенатида(торговоеназваниеByetta®,AstraZeneca) препятствует протеолитическому расщеплению молекулы поданному сайту [47]. Стабильность экзенатида составляет 2.4 ч при сравнении сГПП-1 (1-2 мин).GHRH представляет собой аминокислотную последовательность из 44аминокислот. Поскольку функциональной активностью обладает центральнаяпоследовательность с 1 по 29 аминокислотные остатки, препараты GHRH длятерапевтического применения, как правило, представляют собой белковыепоследовательности,соответствующиеэтомуучастку,амидированныепокарбоксильной группе С-концевого аминокислотного остатка – GRF(1-29)NH2[48].

При сравнении метаболической стабильности и биоактивности аналоговGHRH in vivo показано, что при замене Ala2 на аминокислотные остатки Ser2, Gly2или Thr2 в последовательности [Leu27]GRF(1-29)NH2 в 3-8 раз увеличиваетсяпериод полураспада молекулы [49].Замена аминокислотных остатков может также применяться для увеличениятермостабильности пептидных молекул [50,51], изменения изоэлектрическойточки (аналог инсулина Гларгин, торговое название Lantus®, Sanofi-Aventis) [52],изменения третичной структуры (аналог инсулина лизпро, торговое названиеLispro®, Eli Lilly and Company) [53] и так далее. Однако часто заменааминокислотного остатка повышает протеолитическую стабильность молекулы21против одной протеазы, но может ослаблять против другой [44], поэтому длязамены аминокислотных остатков часто используют D-аминокислоты илимодифицированные аминокислоты.1.5.1.2 Замена на D-аминокислотыD- и L-аминокислоты представляют собой оптические изомеры содинаковыми химическими свойствами, но различающимися так называемойоптической активностью из-за присутствия асимметричного атома углерода вструктуре (исключение – глицин, у которого R=H/радикал боковой цепипредставлен атомом водорода).

Большинство белков включают L-аминокислоты,однако D-аминокислоты найдены во многих организмах, в том числе и ворганизме млекопитающих (например, остеокальцин, эластин, β-амилоид) [54],где они выполняют определенные функции [55–57].Метаболическиеферментыразличаютприродныелигандыиих«зеркальные» изомеры, поэтому большинство из них действуют на связь между Lаминокислотами.

Только несколько ферментов многоклеточных организмовэффективно гидролизуют пептидную связь в соединениях, в состав которыхвходятD-аминокислоты[58].Такимобразом,заменанатуральногоL-аминокислотного остатка его D-изомером снижает специфичность узнавания иаффинность связывания с протеолитическим ферментом, что способствуетувеличению стабильности соединения [41]. Включение D-аминокислоты можеттакже влиять на конформацию пептида, изменяя его сродство к рецептору иселективность [58].Вазопрессин, также известный как антидиуретический гормон (АДГ, AVP,от англ.