Диссертация (Химический состав и биологическая активность гидрофильных фракций из соцветий бархатцев распростертых), страница 5

В качестве ПФ использовали: спирт этиловый 95% –концентрированный раствор аммиака (16:4,5). Полученные хроматограммыобрабатывалирастворомбромкрезоловогозеленого,врезультатечегоорганические кислоты проявились на сине-зеленом фоне в виде желтых пятен[37,48]. Обнаружены кислоты: малоновая, лимонная, янтарная и щавелевая.Содержание органических кислот в пересчете на кислоту янтарнуюпроводили титриметрически [33], используя точную навеску Э-40%Et 10 г.Результаты представлены в таблице 8.Расчет проводили по формуле 1 [2]:X=V x 0,00118 x W1 x 100 x 100 ,a x Va x (100 - W)(1)где: V - объем титранта, израсходованного на титрование, мл;0,00118 - количество кислоты я нтарной, соответствующее 1 мл щелочи(0,01 моль/л), г;W1 - объем мерной колбы для разведения анализируемого извлечения , мл;a - навеска Э-40%Et, г;Va - аликвота анализируемого извлечения , мл;W - влажность Э-40%Et, %.Таблица 8 – Содержание органических кислот в Э-40%EtОбъемтитранта, мл1,10,91,01,20,80,9Содержаниеорганическихкислот, %0,320,310,300,320,340,33МетрологическиехарактеристикиXср = 0,32Sx = 0,006∆х = 0,015Xср ± ∆x = 0,32 ± 0,015ε = 4,8%Из данных, представленных в таблице 8, следует, что суммарноесодержание органических кислот в анализируемом извлечении из соцветийбархатцев составляет 0,32 ± 0,015%.282.1.7 Производные тиофенаСоцветия бархатцев и анализируемое извлечение обрабатывали гексаном иподвергали хроматографическому анализу.

Для обнаружения соединений данногокласса использовали ТСХ на пластинах «Сорбфил». В качестве ПФ использовалин-гексан – ацетон в соотношении 9:1. Хроматограммы рассматривали в УФ-свете(365 нм), наблюдали интенсивную флуоресценцию синего цвета. Значениекоэффициента подвижности составило 0,49 ± 0,04 (рисунок 1) [38,139,144].12Рисунок 1 – Хроматограмма гексанового извлечения из Э-40%Et (1)и соцветий бархатцев распростертых (2)Таккакстандартныеобразцытиофенатруднодоступны,топриколичественном определении мы опирались на данные литературы.

Известно, чтов соцветиях бархатцев распростертых максимальное содержание приходится наα-тертиенил и его изомер, молярная масса которого равна 248 г/моль[135,148,149]. Для расчета количественного содержания нами взят молярныйкоэффициент экстинкции (ε), значение которого составляет 24100 л/моль∙см [38].Измерения проводили при длине волны 344 ± 3 нм (рисунок 2).29Оптическая плотность, А1,81,61,41,210,80,60,40,20200250300350400450500Длина волны, нмРисунок 2 – УФ-спектр извлечения, полученного обработкой Э-40%Et гексаномРезультаты количественного определения производных тиофена методомспектрофотометрии представлены в таблице 9.Таблица 9 – Результаты количественного определения производных тиофенаНавескаЭ-40%Et, гОптическаяплотность3,48700,542Содержаниепроизводныхтиофена0,0423,47630,5340,0413,47680,5390,0423,48740,5460,0423,47550,5310,041МетрологическиехарактеристикиXср = 0,04Sx = 0,0002∆х = 0,0006Xср ± ∆x = 0,04 ± 0,0006ε = 1,5%Таким образом, в Э-40%Et содержание производных тиофена составляет0,04 ± 0,0006%.2.1.8 АминокислотыСодержание свободных и связанных аминокислот, а также элементныйсостав определяли методом капиллярного электрофореза на электрофоретическомприборе Капель №17727-01 на базе Северо-Кавказского зонального научноисследовательского института садоводства и виноградарства в г.

Краснодаре.Методика основана на разделении анионных форм N-фенилтиокарбамилпроизводных аминокислот под действием электрического поля благодаря их30различнойэлектрофоретическойколичественногоопределенияподвижности.анализируемыхДляидентификациикомпонентовирегистрируютультрафиолетовое поглощение при длине волны 254 нм (рисунки 3, 4,таблица 10) [60,66].Рисунок 3 – Электрофореграмма Э-40%Et для определения аминокислотРисунок 4 – Электрофореграмма Э-40%Et для определения кислоты глутаминовой31Таблица 10 – Свободные аминокислоты Э-40%EtАминокислотыаргининβ-фенилаланинтирозинизолейцинлейцинметионинвалинпролинтреонинсеринα-аланинглицинкислота глутаминоваякислота аспарагиноваяСодержание в Э-40%Et, мг/кг17813334,72417043480428032731345605979822561921Таким образом, в анализируемом извлечении обнаружено 14 свободныхаминокислот, из которых 7 – незаменимых (аргинин, β-фенилаланин, лейцин,изолейцин, метионин, треонин, валин).

В наибольшем количестве содержатсяглицин, пролин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты.Изучение количественного содержания аминокислот Э-40%Et проводили виспытательной лаборатории «Центр лекарственного обеспечения Департаментаздравоохранения г. Москвы». Количественное содержание суммы аминокислот визвлечениивпересчетеспектрофотометрическимнаметодом,кислотукоторыйглутаминовуюоснованнаопределяливзаимодействииаминокислот с раствором нингидрина. Оптическую плотность окрашенногокомплекса измеряли при длине волны 570 ± 2 нм. Определение и расчет суммыаминокислот проводили по методике [4].Результаты количественного определения представлены на рисунках 5, 6 и втаблице 11.32Рисунок 5 – Спектр поглощениякомплекса СО кислоты глутаминовой сраствором нингидринаРисунок 6 – Спектр поглощениякомплекса Э-40%Et с растворомнингидринаТаблица 11 – Результаты количественного определения суммы аминокислотв пересчете на кислоту глутаминовую№123456Содержаниеаминокислот, %13,9013,1013,1213,8013,1113,70МетрологическиехарактеристикиXср = 13,46Sx = 0,16∆х = 0,40Xср ± ∆x = 13,46 ± 0,40ε = 2,99%Установлено, что содержание аминокислот в пересчете на глутаминовуюкислоту в Э-40%Et, составляет 13,46 ± 0,4%.332.1.9 Элементный составЭлементныйсоставвЭ-40%Etопределялиметодомкапиллярногоэлектрофореза на электрофоретическом приборе Капель №17727-01 [60,67].Сведения об элементном составе анализируемого извлечения, представленына рисунке 7 и в таблице 12.Рисунок 7 – Электрофореграмма макро-и микроэлементов Э-40%EtТаблица 12 – Содержание микро- и макроэлементов в Э-40%EtЭлементКалийМагнийКальцийНатрийЖелезоМарганецЦинкМедьБорТакимобразом,Содержание в Э-40%Et, мг/кг36740198147738938,26,62,21,61200установлено,чтованализируемомколичественно преобладают калий, магний, кальций, натрий и бор.извлечении342.2 Экспериментальная часть2.2.1 АнтиоксидантыОбщее содержание антиоксидантов в спиртовых, водно-спиртовых иводных извлечениях из соцветий бархатцев определяли на приборе «Цвет Яуза01-АА» амперометрическим методом [124,125].Анализируемые и контрольные растворы кверцетина и кислоты галловойготовили по соответствующей схеме, приведенной в методике [59,75,116].На рисунках 8 и 9 показаны графики зависимости выходного сигнала отКонцентрация кверцетина,мг/лконцентрации.4,543,532,521,510,50y = 0,0008x - 0,1047R² = 0,997501000200030004000Выходной сигнал кверцетина, нАс5000Рисунок 8 – Зависимость выходного сигнала кверцетина от концентрацииКонцентрация кислотыгалловой, мг/л6y = 0,0006x - 0,1524R² = 0,997754321002000400060008000Выходной сигнал кислоты галловой, нАс10000Рисунок 9 – Зависимость выходного сигнала кислоты галловой от концентрации35Результаты полученной суммарной концентрации антиоксидантов висследуемых извлечениях, полученных из соцветий бархатцев распростертых,представлены в таблице 1 (раздел 2.1.1).2.2.2 Полифенольный составC целью определения фенолкарбоновых кислот Э-40%Et растворяли в 2%водном растворе натрия гидрокарбоната, полученный раствор нейтрализоваликислотой хлористоводородной разбавленной, доводя значение рН = 5, после чегов делительной воронке экстрагировали диэтиловым эфиром.

Диэтиловый эфирполностью удаляли, остаток растворяли в спирте этиловом и подвергалихроматографированию с использованием БХ (хроматографическая бумага маркиMunktell Chrom. - Paper Sheets FN 7 (Germany)) и ТСХ (пластины «СорбфилПТСХ-П-А-УФ») [8,76,104].В качестве ПФ использовали: 2% и 15% растворы кислоты уксусной; нбутанол – кислота уксусная – вода очищенная (БУВ) (4:1:5); н-бутанол – 2Маммиак (1:1); система Форесталя (30:3:10) [15,107].После высушивания хроматограммы рассматривали в видимом и УФ-светес последующей обработкой парами аммиака, водным раствором FeCl3, 5%спиртовым раствором AlCl3, реактивом Паули [37].2.2.3 Определение фенольных соединений в Э-40%Et методом ВЭЖХКачественный и количественный анализ фенольных соединений Э-40%Etосуществляли в испытательной лаборатории «Центр лекарственного обеспеченияДепартамента здравоохранения г.

Москвы».Изучение фенольного состава Э-40%Et осуществляли методом ВЭЖХ(приборфирмы«Gilston»,Франция),инжекторручной.компьютерная обработка полученных данных осуществленаПоследующаяс помощьюпрограммы Мультихром для «Windows».Неподвижной фазой служила металлическая колонка, а подвижной фазой –метанол – вода очищенная – кислота фосфорная концентрированная в36соотношении 400:600:5. Анализ осуществляли при температуре 20ºС, скоростьподачи элюента 0,8 мл/мин. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора«Gilston» UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм.Точно измеренную массу Э-40%Et (1,2117 г) переносили в мерную колбуемкостью 100 мл, добавляли по 20 мл спирта этилового 70%, и нагревали притемпературе 90ºС в течение 1 часа.

После охлаждения извлечение фильтроваличерез бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводилиспиртом этиловым 70% до метки (раствор А). Параллельно готовили серию 0,05%растворов CO сравнения в спирте этиловом 70% [29,45,87,99].Результаты проведенных исследований приведены в таблице 4.2.2.4 Определение дубильных веществСодержаниесуммыдубильныхвеществвсоцветияхбархатцевраспростертых определяли двумя методами – перманганатометрическим испектрофотометрическим,основанныхнареакцииосаждения.Дляколичественного определения получали извлечения из соцветий бархатцевэкстракцией водой очищенной и спиртом этиловым 40% с целью установлениянаиболее лучшего экстрагента.Дляколичественногоопределениясуммыдубильныхвеществперманганатометрическим методом 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья(обертки соцветий бархатцев) экстрагировали водой очищенной или спиртомэтиловым 40% (250 мл) на водяной бане в колбе с обратным холодильником втечение 30 минут.

Содержимое колбы охлаждали до комнатной температуры, ажидкую фазу процеживали в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводилисоответствующим растворителем до метки (раствор А). Далее 25 мл раствора Апереносили в колбу объемом 1 л, прибавляли 500 мл воды очищенной, 25 млраствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешиваниираствором калия перманганата (0,02 моль/л) до золотисто-желтого цвета.Параллельно проводили контрольный опыт. Содержание дубильных веществ впроцентах рассчитывали по формуле 2:37X1 =(V1 - V0) x 0,004157 x 250 x 100 x 100 ,a x 25 x (100 - W)(2)где: V1, V0 - объемы растворов калия перманганата, израсходованного на титрованиераствора А и на титрование в контрольном опыте, мл;0,004157 - количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл раствораперманганата калия в пересчете на танин, г;а - масса навески сырья , г;250 - общий объем извлечения , мл;W - влажность сырья , %.Далее проводили осаждение дубильных веществ реактивом осаждения (1%раствор желатина в 10% растворе натрия хлорида).