Диссертация (Химический состав и биологическая активность гидрофильных фракций из соцветий бархатцев распростертых), страница 6

Образовавшийся осадокотфильтровывали, 25 мл фильтрата титровали раствором калия перманганата повышеописанной методике. Расчет оставшихся в растворе окислившихся веществпроводили по формуле 3, где V2 – объем раствора калия перманганата,израсходованного на титрование извлечения после осаждения:X2 =(V2 - V0) x 0,004157 x 250 x 100 x 100 ,a x 25 x (100 - W)(3)Концентрацию дубильных веществ (Х3) определяли по формуле (4):X3 = X 1 - X 2(4)Результаты представлены в таблицах 6, 7.Дляколичественногоопределениясуммыдубильныхвеществспектрофотометрическим методом по вышеописанной методике получалираствор А.

Затем 2 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл,доводили до метки соответствующим растворителем (раствор 1). Измерялиоптическую плотность раствора 1 при длине волны 277 нм. В качестве растворовсравненияиспользоваливодуочищеннуюилиспиртэтиловый40%соответственно.Далее проводили осаждение дубильных веществ. Для этого к 30 млизвлечения добавляли 7 мл реактива осаждения, взбалтывали 60 минут,отстаивали, фильтровали. 2 мл полученного фильтрата переносили в мерную38колбу объемом 50 мл, доводили до метки соответствующим растворителем(раствор 2).

Измеряли оптическую плотность раствора 2 при длине волны 277 нм.В качестве растворов сравнения использовали воду очищенную или спиртэтиловый 40%.Содержание дубильных веществ, после добавления реактива осаждения, впересчетенакислотугалловую(Х4),воберткахсоцветийбархатцевраспростертых определяли как разницу между содержанием дубильных веществ врастворах 1 и 2 (формула 5).X4 =(A1 - A2) x 250 x 50 x 100 ,a x Va x 508 x (100 - W)(5)где: А1 и А2 - оптическая плотность раствора 1 и раствора 2;508 - удельный показатель поглощения галловой кислоты.Результаты определения суммы дубильных веществ представлены в разделе2.1.5.2.2.5 Определение производных тиофенаТочную навеску Э-40%Et (около 3 г) помещали в мерную колбувместимостью 250 мл, растворяли в небольшом количестве спирта этилового40%, затем доводили до метки тем же растворителем.

Полученный раствор вделительной воронке порционно обрабатывали гексаном общим объемом 250 млдополногоэкстрагированиятиофена,котороеконтролировалихроматографически. Полученное гексановое извлечение в течение суток сушилинад безводным натрия сульфатом, после чего переносили в мерную колбувместимостью 250 мл и доводили до метки гексаном (раствор А). Далее измерялиУФ-спектр на спектрофотометре «СФ-103» при длине волны 344 ± 3 нм (рисунок2) [149].Расчет вели по формуле 6:39X = A x M x V x 100 x 100 ,ε x a x 1000 x (100 - W)(6)где: A - значение оптической плотности раствора А;М - моля рная масса α-тертиенила на основании данных литературы [135], г/моль;V - объем раствора А, мл;а - навеска Э-40%Et, г;ε - моля рный коэффициент экстинкции, л/моль.см;W - влажность Э-40%Et, %.Результатыколичественногопредставлены в разделе 2.1.7.определенияпроизводныхтиофена40Выводы по главе 21.

Установлено, что в извлечении из соцветий бархатцев распростертых,полученномспиртомэтиловым40%,содержаниеантиоксидантовмаксимально и составляет 2,771 ± 0,002 мг/г в пересчете на кверцетин и1,894 ± 0,003 мг/г – на кислоту галловую.2. Определены качественные и количественные характеристики биологическиактивных веществ в Э-40%Et, которые представлены флавоноидами,фенолкарбоновыми и органическими кислотами, дубильными веществами,аминокислотами и производными тиофена, макро- и микроэлементами.3.

В анализируемом извлечении из соцветий бархатцев при использованииметодаВЭЖХ найдено 10веществ, из которыхпо наличию СОидентифицировано 7 полифенольной природы: это фенолкарбоновые кислотыи дубильные вещества. Впервые обнаружены танин, кислота галловая,ЭГКГаллат.4. Установлено, что дубильные вещества сосредоточены, преимущественно, вобертках соцветий бархатцев. Проведено количественное определениесоединений данного класса и показано, что спирт этиловый 40% являетсяболее лучшим экстрагентом дубильных веществ, чем вода очищенная.5. Количественное определение основных групп БАВ показало: содержаниедубильных веществ методом перманганатометрии – 0,75 ± 0,03%, методомспектрофотометрии – 0,32 ± 0,01%; содержание органических кислот – 0,32 ±0,015%; производных тиофена – 0,04 ± 0,0006%; содержание свободныхаминокислот составляет 13,46 ± 0,4%, количественно преобладают глицин,пролин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты; по содержанию элементовпреобладают калий, магний, кальций, натрий и бор.41Глава 3 Выделение и идентификация индивидуальных соединений3.1 Выделение индивидуальных соединенийТрехкратной экстракцией (каждый раз по 60 минут) соцветий бархатцевраспростертых спиртом этиловым 40% в соотношении 1:10 при нагреванииполучали извлечения, которые объединяли и сгущали под вакуумом до 100 мл,после чего в делительной воронке обрабатывали гексаном.

В спирто-водномизвлечении выпадал осадок, который обрабатывали ацетоном и подвергалидальнейшему анализу.Далее маточное спирто-водное извлечение последовательно обрабатывалихлороформом, диэтиловым эфиром, этилацетатом и н-бутанолом (рисунок 10)[5,59].Полученныетакимпутемфракциипослеудалениярастворителейпереносили в хроматографические колонки высотой 40-50 см и диаметром 5-10см, заполненные соответствующим сорбентом: cиликагель марки Silicagel L40/100 и полиамид – Polyamide (Polycaprolactam.

Artikel – Nr. 591055, WestGermany).Полученные фракции эмульгировали в небольшом объеме элюента принагревании на водяной бане, после чего в ступке растирали с минимальнымколичеством сухого сорбента до получения сыпучей массы, затем переносили вхроматографическую колонку [27,56,59].Элюентами служили хлороформно-этанольные смеси (при использованиисиликагеля) и водно-этанольные (при использовании полиамида). Процессэлюирования контролировали методом ТСХ и восходящей БХ в различных ПФ(таблицы 13,14) [6,8,12,13,114].В ходе исследования получено 755 фракций.

Объединенные и идентичныепо составу элюаты упаривали до небольшого объема, откуда при стояниивыделялисьосадки,которыезатемотделялииочищалиповторной42кристаллизацией. Индивидуальность веществ доказывали также определениемтемператур плавления (таблица 15) [11,89].Фракцию №1 (ацетоновое извлечение), фракцию №4 (этилацетатноеизвлечение) и фракцию №5 (бутанольное извлечение) переносили в колонку сполиамидом и последовательно элюировали водой очищенной и спиртомэтиловым с интервалом концентраций 10% – 95%. Таким путем выделены 4вещества:из фракций 289-400 (ацетоновое извлечение) получено вещество I, которое вУФ-свете имеет желтую окраску;из фракций 43-51 (этилацетатное извлечение) выделено вещество IV, котороев УФ-свете характеризуется голубым свечением;из фракций 23-127 и 141-198 (бутанольное извлечение) получены 2 вещества:V и VI, имеющие в УФ-свете желтую окраску.Из фракции №2 (хлороформное извлечение) и фракции №3 (эфирноеизвлечение) на колонке с силикагелем выделены вещества II и III.

В качествеэлюентовиспользовалихлороформихлороформно-этанольныесмесивсоотношении 21:1, 18:1, 15:1, 12:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1. Вещество II (из фракции –хлороформное извлечение) в УФ-свете детектируется в виде 2 пятен темножелтой окраски, а вещество III (из фракции – эфирное извлечение) в УФ-светеимеет желтую окраску.Краткая характеристика выделенных веществ представлена в таблице 15.43Растительное сырье – соцветиябархатцев распростертыхТрехкратная экстракцияспиртом этиловым 40%Шрот после экстракцииспиртом этиловым 40%СгущенноеизвлечениеОбработка гексаномСпирто-водноеизвлечениеГексановоеизвлечениеСпирто-водное извлечение после отделения осадка 1Осадок 1ОбработкаацетономФракция №1ОбработкахлороформомФракция №2ОбработкаОбработкадиэтиловым эфиром этилацетатомФракция №3Фракция №4Обработкан-бутаноломФракция №5АцетоновоеизвлечениеХлороформноеизвлечениеЭфирноеизвлечениеЭтилацетатноеизвлечениеБутанольноеизвлечениеКХ наполиамидеКХ насиликагелеКХ насиликагелеКХ наполиамидеКХ наполиамидеЭлюированиехлороформноэтанольнымисмесямиЭлюированиеводноэтанольнымисмесямиЭлюированиеводноэтанольнымисмесямиВещество IIIВещество IVВещества V, VIЭлюированиеводноэтанольнымисмесямиЭлюированиехлороформноэтанольнымисмесямиВещество IВещество IIРисунок 10 – Схема выделения индивидуальных веществПримечание: КХ – колоночная хроматография44Таблица 13 – Сравнительный хроматографический анализ фракций, полученных после обработки различнымирастворителями (ПФ – 15% CH3COOH)5% водный раствор натрияВидимыйПары аммиака5% раствор AlCl3 в этанолеУФ-светкарбонатасветКоэффи(до(доциентВидимыйВидимыйобработки) Видимый светУФ-светУФ-светУФ-светподвижности обработки)светсветОкраска зон адсорбции1) 0,10;1)желтая;1)желтая;1)ярко-желтая;1-3)светло1-3)светло- 1-3)ярко1-3)светло- 1-3)ярко2) 0,19;2,3)темно- 2,3)желто2,3)темноАцетоноваяжелтая;желтая;желтая;желтая;желтая;3) 0,46;желтая;коричневая; желтая;4)б/цв;4)б/цв;4)синяя;4)б/цв;4)синяя;4) 0,61;4)синяя;4)б/цв;4)ярко-синяя;1)ярко1) 0,08;1)светло1)ярко1)светло1)желтая;1)желтая;1)ярко-желтая; 1)желтая;желтая;Хлороформная 2) 0,59;желтая;желтая;желтая;2-3)голубая; 2-3)б/цв;2-3)голубая;2-3)б/цв;2-3)ярко3) 0,74;2-3)б/цв;2-3)голубая; 2-3)б/цв;голубая;1)ярко1)ярко1) 0,08;1)светло- 1)желтая;1)ярко-желтая;1)светложелтая;1)желтая;1)желтая;желтая;Эфирная2) 0,76;желтая;2)голубая;2)ярко-голубая;желтая;2)ярко2-3)б/цв;2-3)б/цв;2)голубая;3) 0,85;2-3)б/цв;3)синяя;3)ярко-синяя;2-3)б/цв;голубая;3)синяя;3)ярко-синяя;1) 0,09;1-3)ярко1-3)ярко1-3)ярко1-3)светло- 1-3)желтая;1)светло2) 0,38;1-3)желтая;желтая;1-3)желтая; желтая;желтая;Этилацетатнаяжелтая;4)голубая;желтая;3) 0,48;4)б/цв;4)ярко-голубая; 4)б/цв;4)голубая;4)ярко4)б/цв;4)б/цв;4) 0,74;голубая;1,3)ярко1,2)ярко1,3)ярко1,3)желтая;желтая;1) 0,10;1-3)светложелтая;желтая;1-3)светло2)желто1-3)желтая;1-3)желтая;2) ярко2) 0,19;желтая;3)ярко-желто2)желтожелтая;Бутанольнаязеленая;4)б/цв;4)б/цв;желто3) 0,42;4)б/цв;зеленая;зеленая;4)б/цв;4)голубая;зеленая;4) 0,58;4)ярко-голубая;4)голубая;4)яркоголубая.Фракции,полученныепо схеме(рисунок 10)4445Таблица 14 – Сравнительный хроматографический анализ фракций, полученных после обработки различнымирастворителями (ПФ – БУВ 4:1:5)ВидимыйУФ-светФракции,светКоэффи(дополученные по(доциентобработки)схемеподвижности обработки)(рисунок 10)1) 0,52;2) 0,63;Ацетоновая3) 0,72;1) 0,08;2) 0,19;Эфирная3) 0,61;4) 0,64;1) 0,13;2) 0,36;Этилацетатная 3) 0,61;4) 0,66;5) 0,79;1) 0,10;2) 0,46;Бутанольная 3) 0,60;1,4)светло- 1,4)желтая;желтая;2,3)синяя;2,3)б/цв;5% водный раствор натриякарбонатаВидимыйУФ-светсвет1,2)желтая;3)б/цв;1)ярко-желтая; 1)желто1)бледно2-5) б/цв;зеленая;желтая;2)ярко-голубая; 2-5) б/цв;3-5)синефиолетовая;1)желтая;2-5)синяя;1)желтая;2)светложелтая;3-5)б/цв;1,4)желтая;2,3) б/цв;1)зеленая;1,4)светло2,3)ярко-синяя; желтая;4)ярко-желтая; 2,3)б/цв;1,4)яркожелтая;2,3)синяя;1,4)желтая;2,3)б/цв;1)желтая;1-3)светло2)темно-желтая; желтая;3)желтая;4,5)б/цв;4)ярко-голубая;5)ярко-синяя;1-3)ярко1-3)светложелтая;желтая;2)темно-желтая;1,3)яркожелтая;2)темножелтая;4,5)синяя;1-3)яркожелтая;1-3)желтая;4,5)б/цв;1-3)светло- 1-3)желтая; 1-3)яркожелтая;4,5)синяя;желтая;4,5)б/цв;4,5)б/цв;1-3)светло- 1-3)желтая; 1-3)желтая;желтая;1-3)желтая;1,2)яркожелтая;3)яркоголубая;1)яркожелтая;2)яркоголубая;3-5)яркосиняя;1,4)яркожелтая;2,3)яркосиняя;1-3)яркожелтая;4)яркоголубая;5)ярко-синяя;1)желтая;2)темножелтая;3)яркожелтая.451) 0,05;2) 0,20;3) 0,32;Хлороформная4) 0,43;5) 0,54;1,2)светло- 1,2)желтая;желтая;3)голубая;3)бесцветная(б/цв);1)светло1)желтая;желтая;2)голубая;2-5) (б/цв); 3-5)синяя;5% спиртовой растворалюминия хлоридаВидимыйВидимый светУФ-светУФ-светсветОкраска зон адсорбции1,2)желтая;1,2)ярко1,2)светло- 1,2)ярко3)б/цв;желтая;желтая;желтая;3)ярко-синяя; 3)б/цв;3)голубая;Пары аммиака46Таблица 15 – Характеристика выделенных веществВещество/Внешний видI) ЖелтозеленыйосадокIII) Светложелтыйосадок267-268°C-314-317°CIV) Желтыйосадок194-196°CV) Светложелтыйосадок251-253°CVI) Желтозеленыйосадок266-268°CРастворимостьРастворим в спирте этиловом(40-95%), ацетоне, хлороформе.Нерастворим в гексане, воде.Растворим в спирте этиловом,хлороформе.