Диссертация (1090339), страница 8
Текст из файла (страница 8)
При охлаждениидо комнатной температуры из концентрированного хлороформного извлечениявыпадал желто-зеленый осадок, который отделяли и на фильтре промывалинебольшим количеством диэтилового эфира. Далее полученное веществоподвергли двукратной перекристаллизации из водного ацетона и получалипорошок желтого цвета с зеленоватым оттенком [82,86].61Методами ТСХ и двумерной БХ в подвижных фазах бутанол – кислотауксусная – вода очищенная (4:1:5) и 15% кислота уксусная установлено, чтополученное вещество является индивидуальным.4.2 Физические характеристики исследуемого вещества4.2.1 ИК-спектроскопияДля идентификации функциональных групп в исследуемом веществеизмеряли ИК-спектры на спектрометре «ИК-фурье ФСМ 1201». С этой целью ИКспектр исследуемого вещества измеряли в вазелиновом масле (рисунок 21).В области 1495-1616 см-1 проявляется полоса С=С ароматической системы.О наличии заместителей в положениях 3´, 4´ можно судить по наличию полоспоглощения в области 676-809 см-1 как результат неравноценности связей С-Нкольца «В».
Фенольные гидроксигруппы проявляются полосами поглощения вобласти 3285 см-1 (3-ОН), 3098 см-1 (5-ОН) и 3642 см-1 (7-ОН) [136,138].Для идентификации метоксигруппы ИК-спектр исследуемого веществаизмеряли в таблетках калия бромида (рисунок 22), для изготовления которыхпредварительно готовили смесь исследуемого вещества и порошка KBr.Полученный образец загружали в пресс-форму ПФ13, которую помещали вгидравлический пресс («Пресс гидравлический ручной ПГР400») как указано вруководстве по эксплуатации прибора. В качестве контрольного образцаиспользовали таблетку калия бромида без исследуемого вещества (рисунок 22).Таким образом, в спектре O-CH3 идентифицируются по колебаниям связи С-Н вобласти 2853 и 2990 см-1, 1377 см-1 и по полосам простой эфирной связи в области1037-1090 см-1 [58,89,138].6262Рисунок 21 – ИК-спектр исследуемого вещества6363Рисунок 22 – ИК-спектр исследуемого вещества641134.2.2 ЯМР- H- и C-спектроскопияДля окончательного доказательства структуры исследуемого веществаиспользовали ЯМР-1H-,13C- и масс-спектроскопию.
С целью получениядостоверных данных измерения проводили на разных приборах: на базе кафедрыхимической технологии и новых материалов МГУ имени М.В. Ломоносова; накафедре фармацевтической и токсикологической химии ФГБОУ ВО ВолгГМУМинздрава России; на кафедре фармацевтической и токсикологической химииПМФИ – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ.В ЯМР-1H- и 13C-спектрах вещества (таблицы 20, 21, рисунки 23, 24, 25, 26)наблюдаются сигналы пяти протонов фенольных гидроксигрупп у С-3, С-5, С-7(кольцо «А»), С-3′ и С-4′ (кольцо «В») в области 9,34-9,32 м.д.Сигналы в области 7,64-6,48 м.д.
соответствуют четырем протонамароматического кольца.В области 3,72 м.д. в виде трехпротонного синглета резонируют протоныодной метоксигруппы.Таблица 20 – ЯМР-1Нспектральные характеристикиисследуемого веществаИсследуемоеПоложениевеществопротонов вструктуреDMSO-d6 400MHzмолекулыH-6´7,50 (d, J=8,4 Hz, 1H)H-86,48 (s, 1H)H-2´7,64 (d, 1H)H-5´6,85 (d, 1H)OH-39,58 (s, 1H)OH-512,54 (s, 1H)OH-710,68 (s, 1H)OH-3´9,32 (d, 2H)OH-4´9,34 (d, 2H)O-CH33,72 (s, 3H)Таблица 21 – ЯМР-13Сспектральные характеристикиисследуемого веществаИсследуемоевеществоАтомDMSO-d6 101MHzC (2)147,73C (4)176,06C (5)151,70C (7)157,23C (8)151,30C (3´)146,95C (4´)145,07C (5´)15,07C (6´)103,38C (8´)93,65O-CH360,016565Рисунок 23 – ЯМР-1H-спектр исследуемого вещества (г.
Москва)6666Рисунок 24 – ЯМР-1H-спектр исследуемого вещества (г. Волгоград)6767Рисунок 25 – ЯМР-13C-спектр исследуемого вещества (г. Москва)6868Рисунок 26 – ЯМР-13C-спектр исследуемого вещества (г. Волгоград)694.2.3 Масс-спектроскопия исследуемого веществаИзвестно, что масс-спектр может быть использован не только дляустановления молекулярной массы вещества, но и уточнения особенностей егостроения, то есть определения наличия в его молекуле некоторых структурныхфрагментов, или функциональных групп. Наиболее распространенными методамиисследованияфлавоноидовспомощьюмасс-спектрометрииявляютсяэлектронный удар. Основные пути распада этих веществ в условиях данногометода описаны в ряде работ [89,138].Следующим этапом наших исследований было установление молекулярноймассы исследуемого вещества.Масс-спектрисследуемоговеществаизмерялинакафедрефармацевтической и токсикологической химии ПМФИ-филиала ФГБОУ ВОВолгГМУ.
С этой целью использовали жидкостную хромато-масс-спектроскопиюИзмерения проводили с использованием системы ВЭЖХ Ultimate 3000(Dionex), сопряженную с масс-детектором AmaZon SL (Bruker), ионизация –электрораспылением.Растворисследуемоговеществахроматографировалинахроматографической колонке Phenomenex Luna C18 размером 150×4,60 мм идиаметром 5 микрон. В качестве первого компонента подвижной фазыиспользовали ацетонитрил от 20% до 80% за 40 минут, а в качестве второгокомпонента – раствор 0,2% кислоты муравьиной.
Скорость потока – 0,3 мл/мин,аналитическая длина волны – 365 нм, температура колонки 30ºС. Общее времяанализа 40 мин.Время удерживания исследуемого вещества в этих условиях составило 32,9мин. Анализ масс-спектра (рисунок 27) показал, что основному пику нахроматограмме исследуемого вещества соответствует величина m/e равная 330,8,что соответствует флавоноиду с молекулярной массой 332.Для достоверности полученных результатов измерения также проводили набазе кафедры химической технологии и новых материалов МГУ имени М.В.Ломоносова.7070Рисунок 27 – ВЭЖХ-хроматограмма и масс-спектр исследуемого вещества (г. Пятигорск)7171Рисунок 28 – Масс-спектр исследуемого вещества (г.
Москва)72Масс-спектрырегистрировалинаквадрупольноммасс-спектрометреFINNIGAN MAT INCOS 50, методом прямого ввода под действием электронногоудара, энергия ионизации составила 70 эВ.Врезультатеанализаданныхмасс-спектравысокогоразрешенияисследуемого вещества отмечено, что оно имеет 100% интенсивность пикамолекулярного иона (m/e 332) и низкую интенсивность пика иона (M – H)+, чтохарактерно для флавонов, содержащих две гидроксильные группы в положениях3-C и 5-C.
На наличие гидроксильной группы у 3-C указывает такжеприсутствующий в спектре пик иона (M – CHO)+ с массовым числом m/e 303.Характеристический ион (M – CH3)+ (m/e 317) и высокоинтенсивный ион (M –CH3CO)+ (m/e)289 подтверждают наличие – метоксигруппы, а ионы с массовымичислами (m/e)137 и (m/e)109 – орто-дигидроксигруппировки в боковомфенильном радикале (рисунок 28).Величины массовых чисел характеристических ионов исследуемоговещества представлены в таблице 22.Таблица 22 – Массовые числа (m/e)характеристических ионов исследуемого веществаЗначения массовых чисел, Относительная интенсивность,m/e%+M332100+(M-H)3314,6+(M-CH3)31713,5+(M-H2O)41443+(M-HCO)3037,2+(M-CH3-CO)28990(a-CH3-CO)1394,5(л)13717(л-СО)1097,5Основываясь на данные литературы можно предположить следующиеИоныструктуры ионов, имеющих диагностическое значение (рисунок 29).73.+OHOHOHOH+HOOHO-CH3OHOOH OOMeOOHOH O(M-CH3) +.-COHOOHHOMeO+OHO+OOHC+MOH+OCOOHOHOHO(M-CH3CO)+HOO+O+(a-CH3CO)OHРисунок 29 – Строение диагностических ионов, образующихся в результате массспектрометрического распада веществаТаким образом, анализ масс-спектра показал, что значение молекулярноймассы исследуемого вещества составило 332.Полученные результаты ЯМР-1H-, 13C-, масс- и ИК-спектроскопии позволяютсделать вывод о том, что выделенное нами вещество соответствует структуре3,5,7,3´,4´-пентаокси-6-метоксифлавона – патулетина (рисунок 30).5'6'HO1873'O26MeO345OHOH4'1'2'OHOHOРисунок 30 – Структура патулетина744.3 Стандартизация патулетинаС полученным веществом в соответствии с требованиями ГФ XIIIпроведены физико-химические исследования, регламентируемые при получениистандартного образца [32].Нами была осуществлена оценка следующих показателей: растворимость,подлинность,температураплавления,удельныйпоказательпоглощения,удельный показатель поглощения с добавлением алюминия хлорида, посторонниепримеси, потеря в массе при высушивании, количественное содержаниепатулетина в исследуемой субстанции.Растворимость.
Определяли в соответствии с требованиями ГФ XIII.Вещество легко растворимо в спирте этиловом 95%, ацетоне, хлороформе,медленно растворим в водном спирте (50-60%), нерастворим в гексане, воде.Подлинность.Определялипообщимкачественнымреакциям,характерным для флавоноидов и, в частности, для флавонолов. Так, в условияхцианидиновойреакции(пробыШинода)наблюдаетсяхарактерноедляфлавонолов ярко-красное окрашивание раствора; с реактивом Вильсона и с 2%спиртовым раствором алюминия хлорида – ярко-желтое окрашивание.Температураплавления.Являетсяважнойхарактеристикойфармацевтической субстанции. Температуру плавления патулетина определяликапиллярным методом. Проведено 6 испытаний (n=6) и определено среднеезначение, которое составило 267-268˚С.Удельный показатель поглощения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
