Диссертация (Разработка методики и технических средств анализа нанообъектов на примере патогенных микроорганизмов в питьевой воде), страница 11

Стекло кварцевое КИ.Стекло КИ кварцевое оптическое, прозрачное в исследуемых областяхдлин волн излучения, без регистрируемой полосы собственного поглощения вданном диапазоне.Спектр пропускания излучения для кварцевого стекла марки КИ изображен на Рис. 3.7 [120].69Рис. 3.6. Спектр пропускания кварцевого стекла КВРис. 3.7. Спектр пропускания кварцевого стекла КИ.

Толщина 10 мм4. Кварцевое стекло КС-4В.Стекло КС-4В кварцевое, особо чистое, с высоким пропусканием в ультрафиолетовом, видимом и инфракрасном диапазонах оптического спектра, изотропное, бессвильное, высшей категории по признаку содержания пузырей ивключений, с высокой радиационно-оптической устойчивостью. Отличаетсяпрактически полным отсутствием гидроксильных групп благодаря специальнойподготовке сырья и вакуумной плавке.Спектр пропускания кварцевого стекла КС-4В толщиной 10 мм показанна Рис.

3.8. [120]. Как видно, для решения поставленной задачи подходят кюветы, изготовленные из материалов КИ, КС-4В.70Рис. 3.8. Спектр пропускания кварцевого стекла КС-4ВВ лабораторном стенде для исследования ВРМБ-метода рекомендуетсяиспользовать кюветы из кварцевого стекла КИ, имеющие следующие параметры:1.Диапазон длин волн, нм — от 190 до 2000;2.Объем пробы, мкл — 1700;3.Длина оптического пути, мм — 5;4.Ширина щели, мм — 10;5.Габариты, мм — 48×12,5×7,5.3.1.3. Требования к метрологическим характеристикаманализатора оптического спектраВ качестве приемника излучения необходимо использовать анализатороптического спектра с высокими требованиями по различным параметрам.

Вопервых, как показано в начале главы, анализатор спектра должен обладать увеличенной областью длин волн для регистрации, чтобы производить конрольдвум гармоникам лазерного источника (от 810 до 1360 нм). Во-вторых, на основерезультатов предыдущих исследований [95, 114] приемник лазерного излучениявыбирается с большим спектральным разрешением. Обнаружение в жидкой сре-71де вирусов возможно при высокой спектральной точности захвата излучения,для наглядности приведем пример спектров люминесценции различных штаммов вируса сальмонеллы (см.

Рис. 3.9). Анализ базы данных полученных ранееспектров [114] показал, что для качественного распознавания характерных особенностей спектральных линий требуется шаг длин волн порядка 0,05 нм.Рис. 3.9. Спектры излучения, прошедшего кювету с раствором вирусов 1 и 2 –различных штаммов сальмонеллы (слева и справа измерения сняты приразличных концентрациях)Поставленная задача заключается в непосредственной сигнализацииналичия патогенных возбудителей, и на данном этапе не содержит проблемуидентификации конкретных штаммов. В связи с этим возможно ограничитьсяабсолютной точностью спектрального разрешения приемника рассеянного излучения Δλ=0,1 нм.Также для обеспечения непрерывного контроля спектроанализатор должен обладать высокими воспроизводимостью, повторяемостью и порогом чувствительности. Подобные требования в совокупности с высокой разрешимостью,которая должна быть совмещена с первичной цифровой обработкой, достижимав приборах векторной обработки сигналов, в основе которых используются преобразования Фурье [53, 72].Из имеющихся на современном рынке приемников лазерного излученияотсутствуют аналоги отечественных производителей, удовлетворяющие постав-72ленным нами требованиям.

Из числа зарубежных линеек анализаторов спектровдля лабораторной установки наиболее подходящими по характеристикам и стоимости, при этом разрешенные к реализации на рынке для использования натерритории Российской федерации, являются анализатор спектра фирмы «Agilent technologies» – Agilent 86140B, а также спектроанализатор Optical SpectrumAnalyzer (OSA) AQ6370 фирмы «Yokogawa Electric Corp». Списки функциональных возможностей рекомендованных приемников представлены в Таблицах 5, 6.Таблица 5.Метрологические параметры анализатора спектров OSA AQ6370Точность измерения длины волныРазрешимость для длины волныМаксимально разрешенная мощностьПорог чувствительностиДинамический порог±0.05 нмОт 0.02 до 10 нм,0.01 нм (для 400-470 нм)+20 дБ-80 дБ60 дБТаблица 6.Метрологические параметры спектроанализатора Agilent 86140BДиапазон длин волнВоспроизводимость 1 минПредельная спектральная точностьТочностьПосле калибровки внутренним источником рабочего спектрального диапазона1480 to 1570 нм1570 to 1620 нмПосле калибровки внешним источникомрабочего диапазона по точкам с шагом±10 нмПосле калибровки внешним источникомполного спектрального диапазонаАбсолютная точностьЧастотная воспроизводимость (<1 мин)от 600 до 1700 нм±0.002 нм0.2 нм для полного диапазона±0.01 нм±0.025 нм±0.01 нм±0.2 нм±0.5 нм±0.002 нм3.2.

Методика проведения экспериментаДля разработки методики проведения эксперимента приведем некоторыерезультаты проведенных ранее исследований [104-105, 108] на Рис. 3.10-3.11. Вданном случае рассмотрим спектральные распределения рассеянного излучения73гепатитом С высокой очистки в воде (Рис. 3.10) и в физическом растворе (Рис.3.11).

Здесь 1, 2, 3 – различная активность возбудителя: 107, 104, 101 ООЕ/мл, соответственно. Сверху на Рис. 3.10, 3.11 представлены графики спектральногораспределения лазера с длиной волны λ=1,017 мкм.Рис. 3.10. Спектры вируса гепатита С в физрастворе при различной активностивозбудителя: 1, 2, 3 – активность 107, 104, 101 ОOE/мл, соответственно.

Для сравнения сверху приведен спектр источника возбужденияРис. 3.11. Спектры вируса гепатита С (высокой очистки) в воде при различнойактивности возбудителя: 1, 2, 3 – активность 107, 104, 101 ОOE/мл74В результате проведенного анализа предшествующих исследований поведения гепатита С в различных растворах обнаружено [108]:При возбуждении спектров вируса гепатита С излучением с длиной волны 1017 нм (Рис. 3.11) в спектрах наблюдается резкое возрастание интенсивности линии 1017 нм по отношению к интенсивности этой линии в спектре чистойкюветы. При этом интенсивность линии люминесцентной линии зависит от концентрации вируса в растворе и, скорее всего, не зависит от свойств раствора.

Повидимому, данное возрастание объясняется резонансом составляющими вирусагепатита С и данной частотой.Анализ погрешностей проведенной ранее серии экспериментов показывает, что результаты исследований не могут быть объяснены случайной ошибкойисследований. Следует отметить, исследование вируса гепатита С показывает,что в спектре пропускания появляется пик излучения, содержащий составляющую на длине волны в диапазоне от 1015 до 1017 нм, в более коротковолновойобласти, чем основное излучение.В результате данного анализа, и в соответствии со схемой (Рис. 3.1) экспериментальный стенд для испытаний ВРМБ-метода включает в себя следующие комплектующие:1.Блок лазерных источников излучения с генерацией волн λ1=1017,λ2=830 нм;2.Корпус установки проб со щелями ввода-вывода светового потока;3.Защитный кожух с крышкой, непрозрачный в диапазоне длин волниспользуемого излучения;4.Оптическое волокно для трансфера оптического потока;5.Кварцевые кювет, регламентированные настоящей методикой;6.Анализаторы спектра «Yokogawa AQ6370» и «Agilent 86140B»,оснащенные встроенными микрокомпьютерами для обработки и передачи спектров в память ЭВМ.Все экспериментальные работы, выполняемые с лабораторной установкой, следует проводить строго в соответствии с общими требованиями безопасности при разработке и эксплуатации лазерных изделий [88].75Класс используемого блока излучателей 3В.

Произведем расчет предельно допустимой мощности используемого лазера [58]:ПДИ = 0,5 ∙ 100.002(−700) = 2,153 (Вт).В разработанной нами установке используется лазеры мощности 150 мВт,следовательно, безопасно проведение экспериментов персоналом вблизи лазерной установки при соблюдении установленных требований и использованиивсех средств защиты перечисленных в [88].Также следует руководствоваться действующей на территории Российской Федерации нормативной документации СанПиН 5804-91 «Санитарныенормы и правила устройства и эксплуатации лазеров».Поскольку узлы экспериментальной установки подключаются к сети220 В, имеющей опасное напряжение, при его эксплуатации необходимо строгособлюдать соответствующие правила электробезопасности в соответствии с [75],руководством по эксплуатации приборов, а также меры противопожарной безопасности в соответствии с [23].Подготовка штаммов для проведения испытаний производится в соответствии со стандартизованными методиками специалистами, имеющими допускдля работы с патогенными возбудителями соответствующих групп.

Все работы смикроорганизмами III-IV групп патогенности проводят квалифицированныеспециалисты в соответствии с [68].Штаммы микроорганизмов выращивают на твердых питательных средах(агаре Хоттингера, рН 7,2 – штаммы Escherichia coli (E.coli), Shigella flexneri(Sh.flex)) 48 ч при температуре 37 оС [80].Бактериальные взвеси микроорганизмов готовят в 0,9 % растворе хлориданатрия. Образец мутности стандартного образца соответствует 10 единицамОСО 42-28-59-85П (10МЕ) ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, что соответствует 1·109 м.к./мл E.coli и Sh.flex. Затем готовят разведения взвесей в дистиллированной воде с 1·108 м.к./мл до конечной концентрации 1·102 КОЕ/мл.

Числоклеток в выращенных комплексах проверяют высевом в пределах 0,1 мл взвесивыращиваемых микробов для всех подготавливаемых штаммов для разведений761·10 КОЕ/мл. Выращиваются организмы в питательные средах регламентиро3ванной плотности. Через 48 ч инкубации в термостате при температуре (37±1) оСподсчитывают число колоний выросших на поверхности агара.

На пластинах врезультате вырастает не менее требуемого числа колоний (40-50).Взвеси микроорганизмов обеззараживают в соответствии с действующимстандартом[68].ВзвесиE.сoliиSh.flexобеззараживаюткипячениемв течение 30 мин.Вначале каждого эксперимента производится прогрев лазерного блока дорабочих температур. Контроль установившегося режима генерации излученияследует производить проверкой отсутствия девиаций лазерной моды при помощи анализатора спектра.Держатель для кювет помещается в непрозрачный кожух и жестко закрепляется на штативе.