Диссертация (Разработка методики и технических средств анализа нанообъектов на примере патогенных микроорганизмов в питьевой воде), страница 14

Пример спектров приведен на Рис. 4.2.Следующим этапом было произведено выделение систематической и случайной составляющих шума. Для этого был собран волоконно-оптический тракт,на оптическом пути в кюветодержатель опускалась пустая кювета. При этом снятые спектральные распределения содержали все случайные погрешности, присущие реальным условиям функционирования разрабатываемого прибора (тепловыепогрешности, появление волоконных мод, погрешности, связанные с фазовымипереходами, люминесценцией оптических элементов и волокна, четырехволновоесмешение и т.д.)На основе полученной базы (свыше 1800 спектров) была разработана система-шум.

Величина выборки принята исходя из отношения уровня сигнала куровню шума [96]. В соответствии с методикой, разработанной в предыдущейглаве, для подтверждения отсутствия нелинейных эффектов в каждом эксперименте помимо спектров рассеянного раствором с образцом излучения, также снимался спектр возбуждающего излучения, прошедшего пустую кювету. На основеполученной базы данных построен график зависимости интенсивности от длиныволны данных спектральных распределений (Рис. 4.3).91Рис. 4.2.

Спектральные распределения лазерного излучения, поданногонапрямую на приемник излучения92Рис. 4.3. Зависимость общей выходной мощности излучения примногократных измеренияхСтатистическая обработка показала характерное падение интенсивностивозбуждающего излучения, а также отсутствие систематической ошибки, поскольку за исключением незначительного пика люминесценции кюветы, общихпризнаков в спектрах полученной базы данных не обнаружено.На данном этапе измерения проводились при различных значениях усреднения, а именно: 1, 10 и 50 спектров.

Примеры усредненных спектральных распределений приведены на Рис. 4.4.Для вычисления значений, близких к оптимальным, для параметров степени усреднения и времени регистрации моды излучения анализатором спектра приоблучении растворов патогенных возбудителей также была проведена дополнительная серия экспериментов.93Рис. 4.4. Спектры лазерного излучения, прошедшего пустую кювету(а, б – измерено при усреднении 10)94Рис. 4.4. Спектры лазерного излучения, прошедшего пустую кювету(в, г – измерено при усреднении 50)95После оценки влияния шумов вызванных установкой на оптическом путипустой кюветы на выходной сигнал было проведено качественное определениестепени влияния состава воды на результаты измерений и составлен оптимальныйнабор параметров эксперимента для минимизации погрешностей, вызванных вариацией концентраций различных примесей, входящих в состав проб воды.

Дляэтого был произведен сбор базы данных спектральных распределений лазерногоизлучения, прошедшего кювету с пробами воды забора из различных участковводоканалов города Москвы и Московской области (в данном случае водозаборбыл произведен в районах Печатники, Северное Бутово, Таганский район, пос.Мосрентген, г. Видное, г.

Коломна), а также города Геленджик. Примеры спектров представлены на Рис. 4.5.Статистические данные выборок различных проб представлены на Рис.4.6. Данные гистограммы показывают количество наблюдений частот, на которыхприходился максимум потерь излучения от источника после прохождения среды.Число наблюдений N=n/50, где n – число спектральных линий без усреднения.Объем выборок не менее тысячи четырехсот спектров для каждой исследуемойпробы. Анализ показал, что погрешность, вызванная различием состава питьевойводы не поддается случайному закону распределения.Правильность результатов измерений оценивается в соответствии с ГОСТР ИСО 5725-6–2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений» [52].Статистическая обработка показала, что основным вкладом вариаций состава воды в спектральное распределение является общее снижение интенсивности спектра, в большей степени основного максимума, соответствующего лазерной моде.

Это связано с тем, что измерения проводятся в длинноволновом области ИК-диапазона (λ=0,81…1,2 мкм), где люминесценция примесей незначительна по сравнению с основной ИК-областью.96Рис. 4.5. Спектры лазерного излучения, прошедшего кювету с водой:а – измерено с усреднением 10, б – с усреднением 50 (источник – г. Видное)97Рис. 4.6. Статистические данные различных проб воды (по основной лазерноймоде): а – г. Видное, б – г.

Коломна98Данные статистической обработки основных параметров спектральныхраспределений излучения представлены в Таблице 7.Таблица 7.Основные статистические параметры спектров проб водыМестозабораПараметрСреднее, ̅ МинимумпробОтносительная ин3,8922,227г. Видное тенсивность, дБмДлина волны, нм1017,4101016,950Относительная ин-13,897-16,941г.Коломна тенсивность, дБмДлина волны, нм1017,0281016,450Таганский Относительная ин4,0782,003тенсивность, дБмрайонг.

Москвы Длина волны, нм1016,8681016,350Относительная инрайон4,5891,711Печатники тенсивность, дБмг. Москвы Длина волны, нм1017,2131015,950МаксимумДисперсия 24,9500,8764711017,8000,263878-11,0341,7671601017,4500,2441496,0741,1619641017,3000,2253006,7261,5294861017,8500,308856Как видно, полученные результаты не имеют общего закона распределения. Для подтверждения отсутствия общих признаков флуктуаций спектральныхраспределений от состава и концентрации проб воды был произведен кластерныйанализ [30] на основе полученных на предыдущем шаге данных.

Число кластеровдля анализа задавалось с точки зрения целесообразности, соответственно, от трехдо восьми. Результаты представлены (только для четырех кластеров) на Рис. 4.7.Расстояние между кластерами сведено в Таблице 8.Таблица 8.Значения параметров кластеров№/№кластера1234123401,5771861,1336161,2157051,57718601,4435711,3614811,1336161,44357101,0820901,2157051,3614811,082090099Рис. 4.7.

Графическое представление кластеров для сводных данных поводопроводной водеКак мы видим, полученные кластеры не имеют общих признаков, а такжеотсутствуют кластеры с равными промежутками между ними, что говорит о случайном характере вносимых в спектр лазера изменений устанавливаемой на оптическом пути излучения воды. Как следствие, вариации интенсивности и плотности мощности полученной базы данных могут быть отнесены к разработанной системе шума, и в дальнейшем учтены при проведении последующих измерений.Проведенный анализ кластеров подтвердил, что усредненная дистанция ивеличины этих кластеров одинаковы, присутствует слабая корреляция от количества разбиений, в результате чего отсутствуют систематические погрешности дляфункции распределения частотных компонент исследуемых спектров [41].Таким образом, проведенная серия экспериментов позволила оптимизировать параметры экспериментальной установки, в том числе требования к лазерному источнику и приемнику излучения, используемым в будущем для макетного100образца.

Во-первых, за счет потерь мощности излучения в растворителе (питьевойводе, не содержащей микробиологические и паразитологические примеси) необходимо использовать источник излучения не менее 270 мВт, а, во-вторых, приемник излучения должен обладать порогом чувствительности не более -50 дБ.Статистическое исследование оптических свойств водопроводной воды,показало, что присутствие веществ не биологического характера не вносит дополнительной нежелательной люминесценции в исследуемом диапазоне длинволн 870-1130 нм. Погрешность максимума спектральной линии лазерного излучения источника не превышает значение 0.03 % и может не учитываться при создании стандартных образцов.4.2. Исследование достоверности экспериментального достиженияпорога вынужденного рассеяния Мандельштама-БриллюэнаПорог возникновения ВРМБ в воде достаточно высок [3], приведем в качестве примера Таблицу 9.

В наших исследованиях [117] мы получали ВРМБ спектры при наличии дополнительного лазерного возбуждения люминесцентногоспектра для ряда патогенных микроорганизмов. Однако для определения минимальной мощности лазеров необходимо провести анализ этого эффекта на стандартном имитаторе.Таблица 9.Пороговые энергии в нефокусированном пучке для обратного ВРМБ, возбуждаемого в фокусе линзы (f = 75 мм)ВеществоХлорбензолВодаСтекло К-8Кварц монокристаллический(вдоль оси Z)λ=1,06 мкм0,01 Дж0,07 Дж0,07 Джλ=0,69 мкм0,02 Дж0,1 Дж0,09 Джλ=0,35 мкм0,01 Дж0,1 Дж-0,06 Дж0,11 Дж0,01 ДжТаким образом, в задачу нашего исследования входит также определениедлины волны лазерных источников излучения, при которых должен быть достигнут порог возбуждения ВРМБ.

В качестве имитаторов патогенных организмовбыли выбраны люминесцентные маркеры – олигонуклеотиды.101Подобный выбор обоснован тем, что рентгеновские спектры этих объектовизвестны и имеют форму близкую к шару, таким образом, вносят минимальнуюпогрешность формы в спектры рассеяния [8].Для исследования были взяты следующие флуоресцентные маркеры:1.Ксантеновые красители: FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, ROX;цианиновые красители: Cy3, Cy5;2.Нанокристаллы Qdot: Qdot® 655 ITK, Qdot® 705 ITK;3.Одностенные углеродные нанотрубки: Sigma 652490-250MG, Sigma685380-100MG, Sigma 652512-250MGОптические свойства маркеров хорошо изучены, в Таблице 10 приведенынаиболее известные и используемые красители [121].Таблица 10.Наномаркеры, используемые в качестве красителейКрасительМаксимумМаксимумКоэффициентКвантовыйпоглощения, нмиспускания, нммолярноговыход, %поглощенияFAM49451965000-TET52153699000-HEX5305569800070R6G52455710800096TAMRA5465799500095ROX5746028000094Су355056515000015Су565067025000015Су3.558159615000028Су5.567560425000028102Схема экспериментального стенда для исследования порога возникновенияВРМБ показана на Рис.

4.8.В экспериментальную установку включены следующие узлы:1.Блок лазеров ИЛПН-246 с генерируемыми на длинах волн излученияλ1 =1017 нм, λ2 = 810 нм;2.Корпус для установки проб с окнами ввода-вывода светового потока;3.Защитный кожух со съемной крышкой, непрозрачный для излученияисследуемого диапазона;4.Оптическое волокно, передающее световой поток;5.Вспомогательный лазерный модуль с длиной волны λ3 =480 нм;6.Набор однотипных кварцевых кювет;7.Штатив;8.Анализаторы спектра «Agilent» и «Yokogawa (характеристики данныхприемников излучения представлены в третьей главе диссертации).Рис. 4.8.

Структурная схема экспериментальной установки103Исследование проводились по следующему алгоритму [86].Вспомогательный лазер, жестко установленный на штативе, и кюветодержатель накрывались защитным кожухом. В держатель для кювет помещалась пустая кювета и накрывалась крышкой непрозрачного кожуха. Посредством одномодового оптического волокна на кювету подавалось излучение с одного из лазеров (например, лазером с рабочей длиной волны λ1=1017 нм) основного блока лазерных излучателей. Рассеянное излучение собирающей оптикой направлялось помногомодовомуволноводунавходанализатораспектра«Agilent»или«Yokogawa». Затем в держатель для кювет помещалась кювета с одним из исследуемых образцов наномаркеров, и в тех же условиях регистрировался спектр образца в отсутствии вспомогательного излучения, содержащий рассеянное излучние, соответствующее люминесценции наномаркера (см.