166048 (Химические методы определения сахаров), страница 4

В заполненных колбочках проводят определение содержания глюкозы колориметрическим методом и строят калибровочную кривую в координатах «оптическая плотность — количество глюкозы, мг».

Определение восстанавливающих сахаров методом Шомадьи — Нельсона (предшественник метода Фолина-Ву)

Колориметрический метод Шомадьи — Нельсона основан на реакции восстанавливающих сахаров с реактивом Шомадьи — Нельсона, в результате которой образуется окрашенное соединение «молибденова синь» общего состава Mo_nO_3n-x голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию восстанавливающих углеводов, которые определяют по величинам оптических плотностей при 508 нм, по калибровочной кривой, составленной с применением модельных растворов. Метод неспецифичен, трудоемок.

Реактивы и материалы: а) Реактив Шомадьи.

a 24 г карбоната натрия и 12 г тартрата калия — натрия (калий натрий виннокислый средний) помещают в коническую колбу вместимостью 500 см³ и добавляют 250 см³ дистиллированной воды. Затем приливают 40 см³10 % раствора сульфата меди, перемешивают и добавляют 16 г гидрокарбоната натрия.

b.18 г Na₂SO₄ растворяют в 500 см³ горячей дистиллированной воды. Раствор кипятят в течение 40 минут для удаления СО₂, затем охлаждают.

Cмешивают (a+b) в мерной колбе на 1 дм³, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. В течение первых двух-трех суток хранения реактива Шомадьи оседает небольшое количество меди с примесями. Этот осадок отфильтровывают, готовый раствор хранят в темной склянке.

б) Реактив Нельсона.

a 25 г модибдата аммония помещают в мерную колбу на 500 см³ и растворяют в 150 см³ Н₂О. Раствор перемешивают, к нему осторожно небольшими порциями добавляют 21 см³ концентрированной H₂SO₄ (х. ч.) при непрерывном перемешивании.

b 3 г гептагидрата гидроортоарсената натрия (Na₂HAsO₄ • 7Н₂О) растворяют отдельно в химическом стаканчике в 50 см³ Н₂О

(a+b). Получается прозрачный раствор светло-желтого цвета, его доводят до метки водой и выдерживают в термостате при 37 "С в течение 2 суток. После выдержки раствор готов к употреблению.

Ход работы.

1.Проведение анализа: К 1 см³ испытуемого раствора добавляют 1 см³ реактива Шомадьи, перемешивают и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 15 минут:

СuSO₄ + 2NaOH [гидролитический] Cu(OH)₂ + Na₂SO₄

Затем к охлажденной смеси добавляют 1 см³ реактива Нельсона и доводят объем до 10 см³ дистиллированной водой:

Na₂HAsO₄ + 15H₂SO₄ + 12(NH₄)₂MoO₄ [в реактиве Нельсона] (NH₄)₃H₄[As(Mo₂O₇)₆] + 21(NH₄)₂SO₄ + Na₂SO₄ + 10H₂O

2(NH₄)₃H₄[As(Mo₂O₇)₆] + Cu₂O 4Mo₆O₁₇ + 2CuO +(NH₄)₂SO₄ + 2(NH₄)₂HAsO₄ + 3H₂O

Оптическую плотность полученного раствора измеряют при 590 нм с использованием кюветы с шириной грани 5 мм.

2.Построение калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят после проведения колориметрической реакции модельных растворов глюкозы с концентрацией от 0,02 до 0,14 мг/см³. Изучаемая зависимость выражается прямой линией, выходящей из начала координат.

Определение фруктозы и других кетосахаров (по Мак-Рери и Слаттери)

Определение основано на способности кетосахаров давать вишневую окраску с резорцином в кислой среде:

Реактивы и материалы: а) Спиртовой раствор резорцина

1 г резорцина растворить в 1 дм³ 95%-ного этанола.

б) 30 %-ный раствор НС1 (не должен давать окраску с резорцином).

в) Стандартный раствор фруктозы

100 мг фруктозы растворяют в 100 см³ насыщенного водяного раствора бензойной кислоты.

г) Рабочий раствор фруктозы

1 см³ стандартного раствора фруктозы разводят в мерной колбе на 100 см³

Ход работы. В пробирку вносят 5 см³ испытуемого раствора (содержащего от 1 до 8 мг фруктозы в 100 см³ раствора), 5 см³ спиртового раствора резорцина и 15 см³ 30 %-ного раствора НСI. Содержимое пробирки перемешивают и помещают на 20 минут в водяную баню при температуре 80 °С. Затем содержимое пробирки охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность на ФЭКе при 540 нм (зеленый светофильтр). В качестве контроля используют раствор, в котором вместо 5 см³ испытуемого раствора берется 5 см³ Н₂О. Количество фруктозы определяют по калибровочной кривой. Для этого готовят серию разведений рабочего раствора фруктозы, в каждом из которых проводят определение фруктозы по описанной выше методике. Калибровочную кривую строят в координатах: «оптическая плотность — количество фруктозы, мг».

Газохроматографическое определение отдельных сахаров

Метод основан на переводе углеводов типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, раффинозы, а также полиолов — сорбита и инозита в пищевых продуктах в триметилсилильные производные с последующей их идентификацией на газовом хроматографе.

Аппаратура, реактивы и материалы: а) Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и устройством для программирования температуры. б) Стеклянная насадочная колонка длиной 2...3 м и диаметром З...4 мм или капиллярная колонка длиной 25...30 м с нанесенной фазой. в) Микрошприц емкостью 1,0...10мкл. г) Роторный испаритель. д)Гексан, х.ч. е)Гексаметилдисилазан. ж) Трифторуксусная кислота или триметилхлорсилан. з) Пиридин, х.ч., безводный. и) Ксилит, х.ч. или инозит. й) Свинец уксуснокислый, х.ч. к) Неподвижные фазы для ГЖХ SE-30, OV-17, ХЕ-60, СКТФТ-50. л) Инертный носитель для ГЖХ: хромосорб-W DMCS, хроматон-N DMCS.

Ход работы.

1. Подготовка образцов к анализу углеводов. Для получения достоверных результатов анализа необходимо учитывать содержание жира и лимонной кислоты в испытуемом образце. Предварительно содержание этих компонентов в пищевых продуктах можно оценить по «Таблицам химического состава пищевых продуктов» и на основании этого выбрать один из следующих способов подготовки образца к анализу.

1.1. Продукты с низким содержанием жира (менее 1,5%).

1.1.1. Продукты с низким содержанием лимонной кислоты (менее 1,5 %). Содержание лимонной кислоты устанавливается по «Таблицам химического состава». К ним относятся соки, вина, пиво, фруктово-ягодные кондитерские изделия, мед, сиропы и др. Навеску гомогенизированной пробы продукта с высоким содержанием сухих веществ (более 60 %) наносят на полиэтиленовую пластинку в количестве 50... 150 мг и взвешивают на аналитических весах с точностью 0,0001 г. На этой же пластинке взвешивают 5... 10 мг ксилита. Пластинку помещают в круглодонную колбу емкостью 10...25 см³ и силилируют без обезвоживания с использованием трифторуксусной кислоты. При использовании триметилхлорсилана содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе при 60 "С под вакуумом. В случае медленного упаривания в колбу добавляют 1 см³ бензола. После упаривания проводят силилирование. Ж идкие продукты отмеряют пипеткой в количестве 0,5... 1,0 см³ и помещают в круглодонную колбу емкостью 10...25 см³, снабженную шлифом. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску 5... 10 мг ксилита, взвешенного с точностью 0,0001 г. Содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе.

1.1.2. Продукты с содержанием лимонной кислоты более 1,5 %. Для исключения наложения пика ТМС-производного лимонной кислоты на ТМС-производное (3-глюкозы, лимонную кислоту осаждают уксуснокислым свинцом. Навеску средней гомогенизированной пробы продукта (свежие цитрусовые плоды, цитрусовые соки, продукты, содержащие лимонную кислоту как пищевую или консервирующую добавку) в количестве 1...1,5г взвешивают с точностью до 0,0001 г в конической колбе емкостью 100 см³, приливают 30 см³ 75...80 %-ного раствора этанола и экстрагируют 30 минут при температуре 60...70°С. Используют водяную баню и обратный холодильник. Экстракцию повторяют трижды, экстракты объединяют. Содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой. В центрифужную пробирку на 10 см³ вносят пипеткой 5 см³ отфильтрованного экстракта, 0,5 см³ насыщенного раствора уксуснокислого свинца. Осадок центрифугируют. 1 см³ надосадочной жидкости переносят в круглодонную колбу со шлифом емкостью 10...25 см³. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску ксилита 5... 10 мг. Содержимое колбы упаривают на роторном испарителе при 60 "С под вакуумом.

1.2. Продукты с высоким содержанием жира (более 1,5%).

1.2.1. Продукты с содержанием лимонной кислоты менее 1,5 % (детское молочное питание, сухие молочные смеси и др.). Навеску средней гомогенизированной пробы продукта с высоким содержанием сухих веществ (более 60%) в количестве 500...1000 мг помещают в центрифужную пробирку. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят с точностью до 0,0001 г навеску ксилита 2...5 мг. Проводят экстракцию с 2 см³ гексана с последующим центрифугированием. Экстракцию проводят трижды, декантируя гексановый слой. Остатки гексана высушиваются в токе азота, после чего проводят силилирование.

Пробу сгущенного молока взвешивают в центрифужной пробирке и проводят обезжиривание, как описано выше, затем добавляют 20 см³ 50 %-ного водного раствора этанола, тщательно перемешивают, затем обрабатывают аналогично жидким молочным продуктам.

10 см³ жидких молочных продуктов помещают в центрифужную пробирку, смешивают с 10 см³ 96 %-ного этанола, выдерживают 30...40 минут и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 минут. 1 см³ надосадочной жидкости помещают в круглодонную колбу, туда же на полиэтиленовой пластинке вносят 2...5 мг ксилита, содержимое упаривают насухо на роторном испарителе при 60 °С, после чего проводят силилирование.

1.2.2. Продукты с содержанием лимонной кислоты более 1,5 % и хлебобулочные изделия. Навеску средней гомогенизированной пробы продукта в количестве 10...15 г, взвешенную с точностью до 0,0001 г, помещают в центрифужную пробирку и подвергают трижды экстракции 30 см³ гексана, объединяя гексановый слой декантированием. Осадок шпателем переносят в коническую колбу вместимостью 100 см³, тщательно смывая остатки со шпателя и пробирки 75 %-ным раствором этанола. Затем трижды экстрагируют содержимое колбы 75 %-ным раствором этанола, подогревая колбу на водяной бане при 60 °С. Отфильтрованные экстракты объединяют и доводят дистиллированной водой до метки в мерной колбе на 100 см³. В мерную пробирку на 10 см³ вносят 5 см³ экстракта и 0,5 см³ насыщенного раствора уксуснокислого свинца. После выпадения осадка надосадочную жидкость в количестве 1,0 см³ переносят в круглодонную колбу вместимостью 10...25 см³. Туда же вносят на полиэтиленовой пластинке 2...5 мг ксилита (с точностью до 0,0001 г) и содержимое колбы упаривают на роторном испарителе при 60 °С под вакуумом, после чего проводят силилирование.

2. Силилирование сахаров.

2.1. Способ с использованием трифторуксусной кислоты. В подготовленную навеску образца приливают 1,0 см³ пиридина (нуклеофильный катализатор), 0,9 см³ гексаметилдисилазана, 0,1 см³ трифторуксусной кислоты (облегчающий алкилирование), плотно закрывают и энергично встряхивают в течение 30 секунд. Вначале наблюдают расслоение жидкости на 2 фазы, при этом нижний слой незначителен. По мере стояния раствора в течение 20...30 минут это расслоение исчезает и начинает выделяться аммиак, что указывает на успешное протекание реакции силилирования:

После прекращения выделения аммиака раствор выдерживают 12 часов при комнатной температуре или 1 час при 60 "С. Длительно сохраняющееся расслоение, исчезающее только при нагревании, говорит о том, что реакция силилирования прошла не полностью из-за высокого содержания влаги (более 40%) или повышенного содержания углеводов. В этом случае подготовку пробы повторяют, уменьшив при этом навеску или увеличив время высушивания на роторном испарителе.

2 .2. Способ с использованием триметилхлорсилана. В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 см³ пиридина, 0,2 см³ гексаметилдисилазана и 0,1 см³ триметилхлорсилана, встряхивают в течение 1 минуты и нагревают в термостате 45 минут при 60 °С:

Затем хроматографируют.