166048 (Химические методы определения сахаров), страница 5

Для упрощения идентификации и количественных расчетов (если не требуется знания аномерного состава сахаров) определение сахаров производят в виде ТМС-производных сахаров. В подготовленную пробу образца добавляют 100 г гидроксиламина солянокислого, приливают 10 см³ пиридина и выдерживают в термостате при 80 °С в течение 2 часов:

Охлаждают и далее приливают силилирующие агенты.

3. Газохроматографический анализ.

1. Подготовка хроматографической колонки. Стеклянную колонку, заполненную готовым сорбентом (количество неподвижной фазы 3...5% от массы носителя) длиной 2 м и внутренним диаметром З мм устанавливают в термостате хроматографа и проводят термокондиционирование при продувании потоком газа-носителя (гелий, азот, водород) 2 ч при 100°С, 2 ч при 150°С, 4 ч при 200°С и 8 ч при 250"С. Затем устанавливают рабочий режим: температуру колонки профаммируют от 125 до 270°С со скоростью 4 °С в 1 мин, температуру испарителя 250 °С, расход газа-носителя 40см³/мин, температура пламенно-ионизационного детектора 250 °С, продолжают кондиционировать в течение рабочего дня.

2. Газохроматографическое определение. 1 мкл пиридинового раствора триметилсилильных производных углеводов вводят в испаритель и элюируют из колонки газом-носителем. Идентификацию индивидуальных триметилсилильных производных проводят по времени удерживания триметилсилильных производных сахаров-метчиков и методом добавок.

3.3. Приготовление стандартных растворов сахаров.

3.3.1. Сахара, имеющие аномеры . Навеску ксилита и навеску определяемого сахара, взятую с точностью 0,0001 г, помещают в коническую колбу и заливают дистиллированной водой до полного растворения углеводов. Раствор выдерживают в течение суток. Аликвотную часть раствора отбирают пипеткой, помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха, после чего проводят силилирование.

3.3.2. Сахара, не имеющие аномеров. Силилируются без предварительного растворения.

Массовую долю отдельных сахаров (в %) в навеске продукта определяют по формуле:

где С, — содержание отдельного сахара в навеске, %; К₁ — поправочный коэффициент данного сахара; С — масса навески стандарта, мг; m — масса навески образца; А_с — площадь пика стандарта в относительных единицах; Л_с— площадь пика данного сахара в относительных единицах.

Ввиду того, что альфа-лактоза и сахароза выходят на хроматограмме одним пиком, площадь пика альфа-лактозы определяют, исходя из соотношения площадей альфа- и бета-лактозы в модельном соединении лактозы. За основу берется площадь пика бета-лактозы. Площадь пика сахарозы определяют вычитанием от суммарного пика сахарозы пика альфа-лактозы, из пика бета-лактозы. За окончательный результат принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений и округляют до трехзначной цифры.

Количественное определение сахаров по реакции с пикриновой кислотой (по Крезелиус – Зейферт)

При взаимодействии редуцирующих сахаров с пикриновой кислотой они окисляются до соответствующих кислот, а пикриновая кислота восстанавливается в пикраминовую, обладающую красной или буровато-красной окраской:

Метод пригоден для количественного определения глюкозы, галактозы, арабинозы, фруктозы, рамнозы, ксилозы, мальтозы, лактозы и крахмала. Метод быстр, но не очень точен. Ошибка может превышать 10-20%. В связи с этим указанный метод имеет ориентировочное значение;

Реактивы и приборы: а) пикриновая кислота, насыщенный раствор; б) углекислый натрий, 20%-ный раствор; в) спектрофотометр.

Ход работы: К 1 мл испытуемого раствора (в котором должно содержаться ее более 3 мг редуцирующих сахаров) прибавляют 2 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 мл раствора углекислого натрия, после чего пробирку переносят на 30 мин. в кипящую водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до объема 10 мл. Оптическую плотность раствора определяют при 455 нм (синий светофильтр). Содержание редуцирующих сахаров рассчитывают по калибровочной кривой, составленной по стандартным растворам глюкозы как в работе «Количественное определение сахаров по антроновому методу».

Определение редуцирующего общего сахара по реакции с 3,5-дииитросалицнловой кислотой

При взаимодействии сахаров с 3,5-динитросалициловой кислотой она восстанавливается в З-амино-5-нитросалицнловую:

В остальном реакция протекает так же, как и с пикриновой кислотой.

Реактивы и приборы: а) динитросалициловый реактив:

В мерной колбе на 1 л растворяют в дистиллированной воде 10 г 3,5-динитросалициловой кислоты, 300 г сегнетовой соли, 16 г едкого натра и доводят водой до метки. Раствор выдерживают два дня в темном месте, затем фильтруют в склянку оранжевого стекла и хранят в темноте;

б) спектроколориметр «Спекол» (ГДР).

Ход работы: К 1 мл испытуемого раствора (где не более 2 мг редуцирующих сахаров) прибавляют 2 мл динитросалицилового реактива, нагревают 5 мин. в кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, после чего доводят до объема 25 мл. Оптическую плотность раствора определяют при 530 нм (зеленый светофильтр).

Антроновый метод определения сахаров (по Моррису-Роэ)

Антроновый реактив образует зеленое окрашивание со всеми растворимыми углеводами, которые в одинаковой концентрации дают окрашенные растворы практически одной и той же оптической плотности.

Это позволяет при определении углеводов использовать калибровочную кривую, составленную по глюкозе, для определения других сахаров в небольших концентрациях (до 0,2 мг в пробе). Точные результаты могут быть получены при наличии высокоочищенных химических реактивов и соблюдении постоянной температуры.

Реактивы и материалы: а) Антроновый реактив

200 мг антрона растворяют в 100 см³ концентрированной серной кислоты (плотность 1,84).

б) 0,5%-ный раствор H₂SO₄

2,8 см³ серной кислоты, плотностью 1,84 растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды.

в) 30 %-ный раствор сернокислого цинка г)15 %-ный раствор желтой кровяной соли 3-водной.

Ход работы. 1 г измельченного материала (корнеплодов, плодов и др.) помещают в 2 мерные колбы на 100 см³. Проводят извлечение сахаров в течение часа с 80 см³ воды при периодическом перемешивании. После этого экстракт осветляют, прибавляя по 1 см³ растворов сернокислого цинка и желтой кровяной соли. Берут 2 пробирки и приливают по 3 см³ антронового реактива, а затем отбирают 1 см³ опытной вытяжки. В качестве контроля используют пробирки, в которых вместо вытяжки добавляют 1 см³ воды. Все пробирки быстро взбалтывают и помещают в кипящую водяную баню на 7 минут. После кипячения пробирки с растворами охлаждают до комнатной температуры, определяют оптическую плотн ость при 610 нм против контрольной пробы. По калибровочной кривой рассчитывают содержание сахаров. Расчет производят по формуле:

где а — количество сахаров, найденное по калибровочной кривой; v — объем экстракта (см³); т — масса навески, взятой на определение.

Определение содержания общего сахара в продуктах кондитерского производства

Считается экспресс-методом, основанным на окислении сахаров дихроматом калия в сильнокислой среде по общей схеме:

Соединения хрома (Ш) окрашены в сине-зеленый цвет, их количество пропорционально содержанию общего сахара в анализируемом продукте.

Реактивы и материалы:

а) Раствор сахарозы — 0,004 г/см³ (стандартный раствор сахарозы).

1,0000 г сахарозы взвешивают с точностью до 0,0002 г и растворяют в мерной колбе вместимостью 250 см3. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой.

б) 1 %-ный раствор дихромата калия (основной реактив).

49 г дихромата калия растворяют при нагревании в 300см³ воды, отдельно в 300 см воды медленно при перемешивании вводят 300 см³ концентрированной H₂SO₄ и охлаждают. В мерную колбу вместимостью 1000 см3 сначала помещают раствор дихромата калия, затем — серную кислоту, объем раствора доводят водой до метки, осторожно перемешивают.

в) Серная кислота — плотность 1,84 г/см³. г) 0,5 М раствор сульфата цинка. д) 1 М раствор гидроксида натрия.

Ход работы.

1. Подготовка к анализу

1.1. Построение градуировочного графика. В 6 мерных колб вместимостью 100 мл вносят по 25 см раствора дихромата калия. Из бюретки последовательно добавляют 0; 2; 4; 6; 8 и 20 см³ стандартного раствора сахарозы. Затем во все колбы из бюретки приливают дистиллированную воду до объема 50 см³, (т. е. добавляют 25, 23, 21, 19, 17 и 5 см³ воды). Получают серии растворов, содержащих соответственно 0, 8, 16, 24, 32 и 80 мг сахарозы в 100 см³. Содержимое колбы нагревают на кипящей водяной бане 10 мин, охлаждают под струей водопроводной воды, объем растворов доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученных растворов на фотоэлектроколориметре при длине волны 670 нм и толщине кюветы 5 см. Раствором сравнения является раствор с нулевой концентрацией сахарозы. Оптическую плотность определяют в каждом растворе не менее 3 раз. Для построения калибровочного графика в координатах «оптическая плотность — количество сахарозы, мг/100см³ » используют среднее значение оптической плотности согласно таблице 3:

1.2. Приготовление вытяжки. Анализируемый образец измельчают в ступке. Затем готовят водную вытяжку объекта исследования. Примерные навески для различных пищевых объектов приведены в таблице 4:

Навеску с точностью до 0,01 г переносят в мерную колбу вместимостью, определенной по табл. 2.5 в зависимости от взятой пробы. Навеску растворяют в дистиллированной воде, нагретой до 60 град С: А. Если изделие растворяется в воде без остатка (сахарные леденцы, сиропы и др.), то полученный в стаканчике раствор охлаждают и переносят в мерную колбу. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и хорошо перемешивают.

1.3.Отделение мешающих несахаров: Если в изделии находятся вещества, нерастворимые в воде «мешающие несахара» — белки, жиры, пектины, крахмал и т. п., то навеску переносят в мерную колбу, смывая частицы дистиллированной водой. Объем жидкости должен быть примерно равен половине объема мерной колбы. Колбу с жидкостью помещают на водяную баню, нагретую до 60 °С (для объектов, содержащих крахмал — до 50 °С). При этой температуре выдерживают колбу в течение 15 мин, периодически перемешивая. За это время практически все сахара переходят в раствор. Охладив раствор, осаждают «мешающие несахара», прибавляя к нему 5см³ 0,5 М раствора ZnSO₄ и 2,5 см³ 1 М раствора КОН или NaOH. Раствор доводят до метки и фильтруют.

2. Проведение анализа. В мерную колбу вместимостью 100 см³ отбирают цилиндром 25 см³ раствора дихромата калия, 10 см³ прозрачного фильтрата и 15 см³ воды, нагревают в течение 10 мин на кипящей водяной бане, охлаждают, добавляют до метки воду, перемешивают. Полученным раствором заполняют кювету и определяют оптическую плотность также, как и при снятии градуировочного графика. По градуировочному графику находят содержание сахарозы (мг/100см³) раствора, что соответствует содержанию сахарозы во взятой пробе, выраженному в мг.

Содержание общего сахара X (%) в анализируемом продукте вычисляют по формуле: