166048 (Химические методы определения сахаров), страница 3

2.2. Содержание сахарозы. В мерную колбу на 100 мл вносят 50 мл фильтрата А, добавляют 5 мл концентрированной соляной кислоты (пл. 1,188) и нагревают, часто взбалтывая, в течение 8 мин. на водяной бане, следя за тем, чтобы жидкость в колбе имела температуру 68—70° С (шарик термометра опущен в колбу). Затем колбу быстро охлаждают (под краном) до 20° С. Охлажденную жидкость нейтрализуют углекислым натрием или 15— 20%-ным раствором едкого натра, контролируя этот процесс лакмусовой бумажкой, опущенной в колбу. Нейтрализованную жидкость доводят водой до метки и в случае необходимости фильтруют. Получают фильтрат Б— инвертный сахар — смесь равных частей глюкозы и фруктозы, освободившихся в результате гидролитического расщепления сахарозы. Содержание редуцирующих сахаров в фильтрате определяют по методу, описанному выше. Содержание сахарозы (в процентах) рассчитывают по формуле

Х_г = (В - А) 0,95,

где В — содержание редуцирующих сахаров после инверсии; А — то же до инверсии (в процентах); 0,95 — коэффициент перевода инвертного сахара в сахарозу.

Суммарное содержание сахаров (в процентах) Х в испытуемом растительном материале рассчитывают по формуле

Х = X_i —1+ Х_г —2

где Хi и Х_г— содержание соответственно редуцирующих сахаров и сахарозы.

4.Метод горячего титрования. Ускоренный метод, основан на способности редуцирующих сахаров восстанавливать в щелочном растворе окисную медь в закисную. Массовую долю сахара определяют путем титрования медно-щелочного раствора фильтратом А.

Материалы и оборудование: титровальная установка, колбы на 50 мл, реактив Фелинга, электроплитка. Ход работы:

1.Проведение анализа: В бюретку вместимостью 10 см³ наливают исследуемый раствор. В две плоскодонные колбы вместимостью 50 см³ отмеряют пипеткой по 5 см3 раствора Фелинга I и раствора Фелинга II. Одну из колб помещают на нагретую электроплитку, доводят медно-щелочной раствор в колбе до кипения и титруют из бюретки фильтратом А со скоростью (4±1) капель в секунду до перехода синей окраски медно-щелочного раствора в желтую. Израсходованный на титрование объем в см³ стандартного раствора сахарозы отмечают по бюретке.

2.Контрольное титрование. Вторую колбу с медно-щелочным раствором помещают на нагретую электроплитку, раствор в колбе доводят до кипения и сливают в него из бюретки (85±5)% израсходованного на предварительное титрование объема исследуемого раствора, следя за тем, чтобы кипение в колбе не прекращалось. При этом синяя окраска медно-щелочного раствора изменяется на светло-фиолетовую. Дотитрование медно-щелочного раствора исследуемым раствором проводят со скоростью 1 капля в секунду до появления желтой окраски. Массовую долю сахара в исследуемом изделии (М) в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

TV₁ ∙100 ∙ 2 100 M= ---------------------- ∙ ------------- mV₂ ∙ 1000 100 - W

где Т — титр медно-щелочного раствора по сахарозе; V₁ — вместимость мерной колбы, взятой для приготовления водной вытяжки, см³; m — масса навески исследуемого изделия, г; V₂ — объем исследуемого раствора, израсходованный на титрование, мл; W— массовая доля влаги в исследуемом материале (ГОСТ 21094); 1000 — перевод мг сахарозы в г; 2 — двойное разведение вытяжки при проведении гидролиза сахарозы.

Физико-химические методы определения сахаров

В настоящее время находят широкое применение физико-химические методы определения сахаров. При этом сахара, путем химических реакций, превращают в какое-то вещество, замеряя затем физические характеристики (цвет, адсорбируемость и пр.) Эти методы быстрые, менее трудоемкие, а в некоторых случаях точнее химических.

Количественное определение сахаров в продуктах растительного происхождения с помощью хроматографии на бумаге (по О. А. Павлюшиной)

Количественное определение сахаров с применением хроматографии на бумаге включает в себя следующие основные операции:

фиксацию растительного материала > экстракцию сахаров и очистку вытяжки от белков и других примесей > распределительную хроматографию сахаров на бумаге > элюацию сахаров с бумаги > определение их содержания в элюатах

Реактивы и материалы: а) Хроматографическая бумага Ленинградская «быстрая» № 1; *Filtrak* FN-4; ватман М 1 и 2; б) этанол, 96%-ный и 80%-ный; в) уксуснокислый свинец (СН₃СОО)₂РЬ ∙ 3Н₂О, 10%-ный раствор; г) сернокислый натрий, насыщенный раствор; д) смесь н-бутанола, пиридина и воды в соотношении 6:4:3 (по объему), или смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5 (по объему). [Если смеси растворителей разделяются на два слоя, то берут верхний;] е) проявители на кетозы: 1 — резорцинфосфат.

0,2 г резорцина растворяют в 100 мл 96%-ноге этанола. Перед проявлением хроматограммы смешивают 10 объемзв спиртового раствора резорцина с одним объемом ортофосфорной кислоты Н₃РО₄ (плотность 1,75—1,82);

2— N-хлормочевина.

5 г мочевины растворяют в 100 мл 96%-ного спирта и добавляют 20 мл 2 н раствора соляной кислоты;

ж) проявители на альдозы: 1 — анилинфталат

1,66 г фталевой кислоты и 0,93 г перегнанного анилина растворяют в 100 мл этилового спирта, насыщенного водой;

2 — анилиноксалат:

0,93 г перегнанного анилина растворяют в 50 мл 96%-ного этанола, после чего смешивают с равным объемом 0,2 М раствора щавелевой кислоты в этаноле (можно также брать водный 0,2 М раствор щавелевой кислоты);

и) глюкоза, фруктоза, сахароза и другие сахара, 2%~ные растворы; к) другие реактивы для количественного определения сахаров по антроновому методу.

Ход работы: Навеску свежего растительного материала (10—-30 г) заливают (для фиксации) десятикратным объемом кипящего 96%-ного этанола, нагревают 2—3 мин., добавляя небольшое количество углекислого кальция или натрия в порошке для нейтрализации кислот (под контролем лакмуса или универсального индикатора). Зафиксированная навеска (в колбе или склянке с притертой пробкой) может храниться в течение нескольких месяцев (в темном и прохладном месте). Фиксация спиртом является и началом экстракции сахаров, которые частично переходят в раствор. Сахара экстрагируют горячим (70—80 ºС) 80%-ным этанолом 3 раза по 30 мин. Перед началом экстракции рекомендуется дополнительно растереть материал в ступке. Спирт, который служил для фиксации навески, объединяют со спиртовыми вытяжками. После каждой экстракции охлажденную спиртовую вытяжку центрифугируют. Объединенные спиртовые вытяжки сгущают в вакууме до объема 3 мл. Если материал богат хлорофиллом и каротиноидами, то сгущенную вытяжку несколько раз взбалтывают с петролейным эфиром. Эфирный раствор пигментов сливают, а остатки растворителя удаляют на водяной бане при 50—60°. Сгущенную вытяжку количественно переводят в мерную колбу на 5 или 10 мл. Для осаждения белков и других примесей прибавляют по каплям раствор уксуснокислого свинца. Проверив полноту осаждения, раствор в колбе доводят до метки, затем фильтруют или, еще лучше, центрифугируют. Для осаждения избытки свинца, не пошедшего в реакцию, добавляют одну каплю насыщенного раствора сернокислого натрия и снова центрифугируют или фильтруют. Нарезают полосы хроматографической бумаги длиной 50—55 см и шириной 13—19 см или другого размера (в зависимости от диаметра хроматографической камеры). Бумагу разлиновывают графитовым карандашом, оставляя с одной стороны листа одну, а с другой — две контрольные полосы шириной 2— 2,5 см. Низ хроматограммы вырезают зубцами, что способствует равномерному скапыванию растворителя и предотвращает наблюдающийся иногда перекос пятен. Затем на линию старта отдельными пятнами по одному на основной части хроматограммы и на каждой из контрольных полос наносят с помощью микропипетки или капилляра определенный точный объем испытуемого раствора (например, по 0,01; 0,02 или 0,03 мл в пятно). Количество экстракта, наносимого в пятно, должно соответствовать примерно 30—50 мг сырого веса исследуемого материала в том случае, если в нем содержится 5—7 мг глюкозы, фруктозы и сахарозы на 1 г сырого веса ткани. Для установления оптимальной концентрации сахаров, вносимых в пятно, ставят отдельно две контрольные хроматограммы с нанесением различных объемов опытного экстракта (0,01—0,04 мл в пятно). На те же полосы наносят также и метчики — растворы сахаров (по 0,004 мл 2%-ных растворов). После нанесения растворов на бумагу приступают к разделению сахаров в соответствующей смеси растворителей (н-бутанол — пиридин — вода, 6:4:3; н-бутанол — уксусная кислота — вода, 4:1:5). Хроматография нисходящая. Продолжительность разделения 2—3 суток. После разделения хроматограммы высушивают в токе воздуха (в вытяжном шкафу) до полного удаления следов растворителя. Следующей задачей является определение положения пятен на основной части хроматограммы, так как сахара элюируют из непроявленной части бумаги. Для этого от основной хроматограммы отрезают контрольные полосы (а), (б) и (в) и опрыскивают две из них, например (а) и (б), проявителями на кетозы — резорцинфосфатом (реакцией Ф.Ф. Селиванова):

или раствором N-хлормочевины:

а (в) — проявителем на альдозы — анилинфталатом (анилиноксалатом):

Полосу, опрыснутую резорцинфосфатом, прогревают 3—4 мин. в сушильном шкафу при температуре 85—95ºС. Пятна фруктозы, сахарозы, раффинозы и олигосахаридов, содержащих фруктозу, окрашиваются в интенсивно розовый цвет. При нагревании хроматограммы, опрыснутой раствором хлормочевины, в течение 5 мин. при 105 ºС пятна альдоз принимают синее окрашивание. Полосу, обработанную раствором анилинфталата или анилиноксалата, нагревают при 105—110 ºС. При обработке хроматограммы анилинфталатом глюкоза и галактоза проявляются в течение 5 мин. при 105°С в виде желтовато-коричневых пятен; пятна пентоз вишнево-красного цвета. Мальтоза и лактоза дают желто-коричневые пятна при нагревании в течение 20 мин. при 105 ºС. При проявлении анилиноксалатом (110°С, 5—6 мин.) пятна альдоз имеют коричневое окрашивание. Проявленные контрольные полосы (а), (б) и (в) прикладывают к основной части хроматограммы (в) и таким образом определяют положение пятен отдельных сахаров на полосе (в), не проявляя ее. Участки бумаги, содержащие не проявленные пятна глюкозы, фруктозы, сахарозы и олигосахаридов, вырезают, разрезают на маленькие кусочки («лапшу») и элюируют сахара водой три раза по 30 мин. при 60—70°. Элюаты фильтруют через маленькие бумажные фильтры, выпаривают на водяной бане до небольшого объема, снова фильтруют и доводят до определенного объема. В растворе определяют содержание сахара с помощью антронового реактива.

Определение восстанавливающих сахаров колориметрическим методом (по И. С. Лурье)

Метод основан на взаимодействии восстанавливающих сахаров при нагревании со стандартным щелочным раствором красной кровяной соли. При этом ее часть восстанавливается в желтую кровяную соль.

С₆Н₁₂О₆ + 2K₃[Fe(CN)₆] + 2KOH = СН₂ОН(СНОН)₄СООН + 2K₄[Fe(CN)₆] + Н₂О

Избыток феррицианида определяют на фотоэлектроколориметре по характерному поглощению в области 420...440 нм (синий светофильтр). Расчет восстанавливающих сахаров ведут по калибровочной кривой. Метод удобен для серийных анализов и применим в тех случаях, когда испытуемый раствор не содержит других веществ, взаимодействующих с феррицианидом, а также веществ, имеющих поглощение в данной области спектра. При работе с биологическим материалом, исследуемые вытяжки бывают очень сложны по своему составу, часто опалесцируют, поэтому требуется определенная подготовка образца. Метод очень удобен для изучения накопления восстанавливающих сахаров под действием ферментов, гидролизующих углеводы, в экспериментах, моделирующих технологический процесс. В этом случае исследователя интересует не абсолютное содержание восстанавливающих сахаров, а их увеличение за счет ферментативной реакции. При этом факторы, влияющие на величину оптической плотности, нивелируются контрольными или нулевыми замерами.

Реактивы и материалы: а) 1 %-ный раствор феррицианида (10 г в 1 дм³). б) 1,25 н. раствор КОН (70 г в 1 дм³). в) 1 %-ный исходный раствор глюкозы. г) 0,1 %-ный и 0,2 %-ный рабочие растворы глюкозы.

Ход работы.

1.Выполнение анализа: В коническую колбу на 100 см³ вносят 10 см³ раствора феррицианида, 5 см³ раствора щелочи и от 1 до 5 см³ испытуемого раствора. Если объем пробы меньше 5 см³, то недостающее количество компенсируют водой. Колбочку прикрывают часовым стеклом и на слабом огне доводят до кипения. Кипятят ровно 1 минуту. Затем содержимое колбочки охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность на ФЭКе при синем светофильтре (420 нм). Количество сахара в испытуемом растворе определяют по калибровочной кривой.

2.Построение калибровочной кривой: Концентрацию исходного раствора глюкозы устанавливают по методу Бертрана. Для этого берут три пробы по 5 см³ 1 %-ного раствора глюкозы, добавляют к каждой пробе по 15 см³ воды и 40 см³ реактива Феллинга. Концентрацию исходного раствора глюкозы рассчитывают как среднее значение из трех параллельных определений. Точную концентрацию рабочих растворов глюкозы рассчитывают по данным анализа исходного раствора. Сухие конические колбочки на 100 см³ заполняют согласно табл. 2.