Диссертация (Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus)

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

__________________________________________________________________

На правах рукописи

ХАСАЕВА Фатимат Машировна

ДЕГРАДАЦИЯ ПИРИДИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЯМИ РОДОВ ARTHROBACTER И RHODOCOCCUS

Специальности 03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва, 2010 г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического и в лаборатории масс-спектрального анализа химического факультетов МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор

Нетрусов Александр Иванович

доктор химических наук, профессор

Лебедев Альберт Тарасович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Эль- Регистан Галина Ивановна

доктор биологических наук

Солянникова Инна Петровна

доктор биологических наук, профессор

Градова Нина Борисовна

Ведущая организация: Российский государственный университет нефти и газа

им. И.М. Губкина

Защита состоится 14 декабря 2010 года в 15 часов 30 мин на заседании Диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы дом 1, МГУ, корпус 12, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 12 ноября 2010 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время практически все природные среды подвергаются антропогенным воздействиям. Интенсивное развитие химической промышленности привело к тому, что в биосферу постоянно и в возрастающих количествах поступают вещества-загрязнители. Попадая в окружающую среду, они широко распространяются в природных ландшафтах, циркулируют в трофических цепях и накапливаются в организмах животных и человека. Это серьезно угрожает здоровью, и даже жизни всех живых существ, включая человека, повреждая клетки и вызывая мутации, ведущие к развитию злокачественных процессов или наследственных заболеваний. Особую опасность для природных экосистем представляют сточные воды коксохимических, нефтеперерабатывающих, фармацевтических и других предприятий химической промышленности. Они содержат токсичные и канцерогенные органические вещества первого и второго классов опасности, составляющие наиболее многочисленную группу (от 60% - 80% контролируемых веществ), интервал допустимых концентраций которых составляет от 10^-4 – 10^-7 мг/л. В течение года в природные резервуары поступает до 100 тыс различных химических соединений, 60 млн т синтетических материалов и до 5 млн т пестицидов [Кузнецов, Градова, 2006].

Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость ксенобиотиков различных классов, для изучения процессов их деградации были выбраны азотсодержащие ароматические арены, к которым относятся пиридин и его производные [Rogers et al., 1985].

Санитарным законодательством предельно-допустимая концентрация (ПДК) для пиридина в питьевой воде установлена на уровне 0,2 мг/л, пиколинов и лутидинов 0,05мг/л, паров в воздухе 0,0015 мг/л [ГН 2.1.5.2280-07, 2007], а для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение – 0,01 и 0,001 мг/л, соответственно [Перечень рыбохозяйственных нормативов, 1999]. Такие значения ПДК предполагают глубокую очистку сточных вод. На данный момент предложены различные физико-химические способы очистки: адсорбция [Akita, 1993; Sabah, 2002], адсорбция с электросорбцией [Niu, 2002], озонирование [Stern, 1997], ионный обмен [Алиева, 1987], но ни один из современных методов химической очистки не может считаться ни экономичным, ни эффективным. Биологический метод очистки обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых относится его экологичность: в процессе биологической очистки не образуется чуждых природной среде соединений и происходит деструкция органических загрязнений до СО₂ и Н₂О [Лохова, 2009].

Современный уровень развития общества, промышленного производства, экологическое состояние окружающей среды обусловили повышение требований к качеству сточных вод, сбрасываемых в водные объекты, а традиционные технологии биологической очистки в аэротенках уже не позволяют достичь необходимой степени очистки.Одним из наиболее эффективных и очевидных способов увеличения окислительной мощности и улучшения ряда технологических показателей традиционных биологических очистных сооружений является применение иммобилизации биомассы на нерастворимых в воде материалах [Демаков и др., 2009].

В связи с этим первостепенное значение приобретает разработка микробио-логических способов очистки, предусматривающая поиск эффективных микро-организмов-деструкторов, всестороннее их изучение, подбор оптимальных способов хранения, обеспечивающих сохранение, как жизнеспособности, так и ферментативной активности, исследование путей и химических превращений ксенобиотиков и дальнейшее использование этих микроорганизмов в процессах очистки промышленных сточных вод и биоремидиации почв.

Состояние вопроса. К началу настоящей работы было известно, что первичной реакцией метаболизма бензольного кольца является его гидроксилирование с образованием диоксисоединений [Арчаков, 1983; Leslie, 1985; Кулинский, 1999; Соляникова, 2007]. Последующее раскрытие кольца может проходить по одному из известных типов окислительного его расщепления: орто-, мета- и расщепление по пути гентизиновой кислоты.

В отличие от бензольного, реакции раскрытия пиридинового кольца не имеют однозначной интерпретации. Это, с одной стороны, обусловлено тем, что пиридин является электронодефицитным соединением, поскольку замена в кольце бензола одного атома углерода более электроотрицательным атомом азота приводит к резкому перераспределению электронной плотности в ядре так, что в положениях 2- и 4- электронная плотность понижена [Гранберг,1973, Пожарский,1986]. В результате наряду с повышенной основностью пиридина (за счет свободной пары электронов азота), его электрофильность резко подавлена, а нуклеофильные реагенты атакуют α- и γ - положения в ядре. Таким образом, нуклеофильная атака, например, введение ОН-группы, становится более легкой по сравнению с электрофильным замещением (Джилкрист, 1996). С другой стороны, до сих пор не удалось получить бактериальные бесклеточные экстракты, способные трансформировать молекулу пиридина: отсюда многие стадии его деградации остаются неизученными.

Немногочисленные данные о микробном метаболизме пиридина и алкилпиридинов свидетельствуют о различающихся процессах их разложения

Такие штаммы бактерий как Brevibacterium sp. [Shukla, 1973]; Corynebacterium sp. [Shukla, Kaul, 1974]; Bacillus sp. шт. 4 [Watson, Cain, 1972]; Nocardia sp. [Watson, Cain, 1975]; Micrococcus luteus [Sims et al., 1985, 1986] могут использовать пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при его концентрации 1,5-2,0 г/л и времени утилизации от 2 до 5 дней. Первыми идентифицированными интермедиатами оказались насыщенные алифатические кислоты, янтарный и глутаровый полуальдегиды, присутствие которых свидетельствует о восстановлении пиридинового кольца [Shukla, 1973; Watson, Cain, 1975]. Вполне вероятно, что интермедиатом при деградации пиридина является 1,4-дигидропиридин (Watson, Cain, 1972), однако прямых доказательств этого процесса нет, первичные продукты восстановительной реакции не были выделены. Исследования девяностых годов дали несколько другие результаты. Бактерия Nocardia sp. КМ-2 (Коростелева, 1982) утилизировала пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при максимально потребляемой концентрации 0,2% за 96 часов. В КЖ накапливался интермедиат, который был идентифицирован как 3-гидроксипиридин, что предполагает раскрытие кольца пиридина, предшествующее его окислению. И в этом случае в качестве интермедиата был идентифицирован янтарный полуальдегид.

На данный момент в научной литературе представлены работы по изучению биодеградации небольшого ряда алкилпиридинов, в основном метил- и этил- производных пиридина. [Bai, 2008; Stobdan, 2008; McCulloch, 2009.] В основном описаны кинетические зависимости разрушения субстратов ограниченным числом различных видов микроорганизмов, и достаточно скудно представлены материалы по изучению путей метаболизма этих соединений. К настоящему времени нет четких, обоснованных данных о путях деградации пиридина и его производных, а также диагностике штаммов, обладающих высокой деструктивной активностью по отношению к этим сильнейшим токсикантам. Так как до сих пор не удалось получить бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридины, не были определены и охарактеризованы ферменты биодеградации пиридинового кольца.

Цель. Целью работы было исследование микробной деструкции пиридиновых загрязнителей: поиск и выделение высокоактивных штаммов-деструкторов пиридина и его производных; изучение их физиологической активности; а также исследование путей и направлений биохимических реакций разложения пиридинов для использования выявленных закономерностей и выделенных бактерий – деструкторов в биотехно-логических процессах очистки промышленных сточных вод и биоремидиации почв.

Основные задачи исследований:

1. Поиск и выделение высокоактивных бактерий-деструкторов пиридиновых соединений, идентификация выделенных штаммов бактерий.

2. Изучение кинетических параметров и подбор оптимальных условий для утилизации пиридина и пиридиновых производных выделенными штаммами.

3. Оценка выживаемости и сохранения утилизирующей активности бактерий-деструкторов по отношению к исследуемым субстратам после 20 лет хранения штаммов.

4. Выделение, характеристика и определение структуры индивидуальных продуктов интермедиатов биодеградации пиридинов, методами хроматографии и хроматомасс-спектрометрии.

5. Установление путей деградации пиридина и его производных в процессе их разрушения выделенными бактериями.

7. Масс-спектрометрический анализ белкового профиля бактерий родов Arthrobacter sp. КМ-Р и Rhodococcus wratislaviensis KM-P, утилизирующих пиридин, методом матрично-активированной лазерной десорбции /ионизации (МАЛДИ).

8. Иммобилизация клеток бактерий Arthrobacter sp. КМ-Р, утилизирующие пиридин, в альгинате кальция для разработки основ биотехнологического процесса деструкции ксенобиотиков этого класса.

Научная новизна работы. Выделены бактерии-деструкторы пиридинов из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» и предприятия по синтезу легких пиридинов. Выделенные штаммы обладали исключительно высокой деградирующей активностью, были идентифицированы на основании морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств и результатам сиквенирования 16S рРНК как представители родов Аrthrobacter и Rhodococcus .

Исходный штамм Аrthrobacter sp. КМ-4 и полученные варианты обладали широкой субстратной специфичностью по отношению к производным пиридина.

Установлено, что деградация, как незамещенного пиридина, так и его производных выделенными микроорганизмами происходит по окислительному пути: гетероциклическое кольцо на первом этапе подвергается гидроксилированию вС-2 и (или) С-3 положении цикла. Впервые в качестве промежуточных продуктов метаболизма пиридина выявлены 2-гидрокси-, 2,3-дигидрокси- и 2,6-дигидроксипро-изводные. Обнаружение продуктов гидратации пиридина у Аrthrobacter sp. КМ-P и Rhodococcus wratislaviensis KM-P предполагает происхождение атома кислорода в гидроксильных группах у С-2 и С-6 из воды. На основании анализа продуктов раскрытия дигидроксипроизводных установлено, что пиридиновое кольцо подвергается гидролитическому разрыву по С–N связи обоими штаммами бактерий. Впервые при изучении метаболизма 2-МП показано, что раскрытие кольца гидрокси-2-МП между 2-м и 3-м атомами углерода с последующей реакцией конденсации приводит к образованию N-ацетилпиррола. Раскрытие кольца между 5-м и 6-м атомами углерода, аналогично, приводит к образованию N-формил-2-метилпиррола, т. е. раскрытие кольца наблюдается и в орто- и в мета-положении. В процессе метаболизма 4-МП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-4МР образуются розовый и голубой пигменты, которые являются продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4- и 2,3,6-тригидрокси-4-МП, соответственно. Метаболизм 2,4-ДМП сопровождается окислением как кольца гетероцикла, так и метильных групп. Утилизация 2,6-ДМП сопровождается образованием 3,4-дигидрокси-2,6-диметилпиридина, с раскрытием кольца в мета-положении.