Диссертация (Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus), страница 5
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus". Документ из архива "Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой докторскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук.
Онлайн просмотр документа "Диссертация"
Текст 5 страницы из документа "Диссертация"
Таким образом, исследования по оценке эффективности использованных защитных сред при лиофилизации и криоконсервации как жизнеспособности клеток, так и их утилизирующей активности по отношению к 2,6-ДМП, и подтвержденные «тестом на ускоренное хранение» позволили рекомендовать для длительного хранения штамма Arthrobacter sp. KM-4 использование лошадиной сыворотки с 5% раствором мезо-инозита в качестве защитной среды.
После 20 лет хранения штаммов – деструкторов количество жизнеспособных клеток составило 107 кл/мл, что достаточно для восстановления бактериальной популяции [Ившина, 2005]. Исходная плотность клеток в суспензии для консервации составляла 109 кл/мл. Оценка утилизирующей активности штамма при росте на среде, содержащей 2,6-ДМП как источник азота, показала, что способность утилизировать субстрат, на котором он был выделен, сохранилась на высоком уровне. К деструкции пиридина, 2-МП и 2,6-ДМП, варианты штамма Arthrobacter sp. KM-4 приступали без лаг-фазы. Первоначальная активность бактерий (1,5, 2,0 и 3,0 г/л упомянутых субстратов соответственно за 24 ч), восстановилась за несколько пассажей на минеральной среде с субстратами. В результате многократных пересевов активность вариантов штамма значительно возросла и в настоящее время оценивается утилизацией по 2,5 г/л пиридина и 2-МП за 24 часа. Восстановительный период для штамма Rhodococcus wratislaviensis KM-Р, разрушающего пиридин, длился месяц. При длительных пересевах активность штамма возросла с 1,5 г/л за 36 часов до 2,5 г/л за 24 часа. Для штамма Rhodococcus erythropolis 2.4DMP разрушающего 2,4-ДМП, адаптационный период был длительным (1 год).
4. Масс-спектрометрический анализ клеток бактерий. Масс-спектрометрия была впервые применена для анализа микроорганизмов по типу «отпечатков пальцев» в 70-х годах прошлого века [Anhalt, Fenselau, 1975], используя в качестве одного из маркеров белки. Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) позволяет получить информацию о молекулярной массе белков, и продуктов их энзиматического расщепления. Наиболее часто используемые матрицы при исследовании белкового профиля бактерий: 2,5-дигидроксибензойная (DHB); α-циано-4-гидроксикоричная (HCCA); синапиновая кислоты (SA).
4.1. Сравнительный анализ биодеградирующих штаммов Arthrobacter sp. КМ-P и Rh. wratislaviensis КМ-Р методом МАЛДИ. Исследуемые штаммы – деструкторы пиридина представлены грамположительными клетками, их суспендирование проводили в 50% растворе ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУК) с обработкой клеток ультразвуком для разрушения клеточной стенки. Первый этап работы включал подбор подходящей матрицы. Были опробованы DHВ, HCCA, SA. При использовании DHВ не удалось получить хорошего разрешения анализируемом диапазоне масс. На рис. 12 приведены два спектра МАЛДИ для штамма Arthrobacter sp. КМ-P, полученных на HCCA и SA. Видно, что при использовании SA визуализируется гораздо больше пиков, следовательно, полученный МАЛДИ-спектр является более полным.
Рис. 12. МАЛДИ-профили штамма Arthrobacter sp. KM-Р на двух разных матрицах.
Аналогичная картина наблюдалась и для Rh. wratislaviensis КМ-Р. Для проведения последующих экспериментов в качестве матрицы использовали SA.
На рис. 13 приведены масс-спектры сравниваемых штаммов на среде с пиридином. Детальный анализ обнаруживал шесть сигналов с одинаковым значением m/z, различающиеся только интенсивностью.
Рис. 13. МАЛДИ-профили пиридин-деградирующих штаммов: a – Arthrobacter sp. KM-P; b – Rh. wratoslaviensis KM-P.
На рис. 14 приведена гистограмма, демонстрирующая степень схожести белковых профилей клеток исследуемых бактерий.
Р
ис. 14. Сравнение относительной интенсивности пиков, общих для штаммов Arthrobacter sp. KM-Р и Rh. wratislaviensis KM-P.
Таким образом, для двух немицелиальных актино-бактерий разных видов при анализе методом МАЛДИ удалось выявить сходство их белковых профилей. Можно предположить, что белки, дающие сигнал в спектре обоих штаммов, относится к ферментной системе, осуществляющей деградацию пиридина.
4.2. Влияние условий культивирования на МАЛДИ-профиль бактерий. Анализ проведен на примере штамма Arthrobacter sp. KM-P. Постулируется, что вне зависимости от условий культивирования клетки конкретного микроорганизма вырабатывают определенный набор белков, пики молекулярных ионов которых должны присутствовать в спектре [Bernardo et al., 2002]. При этом, безусловно, возможны существенные изменения в интенсивности соответствующих пиков.
Для проведения сравнительного анализа белковых профилей, полученных методом МАЛДИ, клетки Arthrobacter sp. КМ-Р выращивали на трех различных средах: агаризованной минеральной среде с пиридином (АМП), сусло-агаре (СА) и мясо-пептонном агаре (МПА). На рис. 15 приведены полученные для всех трех вариантов спектры.
Рис. 15. Белковые профили (МАЛДИ) штамма Arthrobacter sp. КМ-P на разных средах.
Как и предполагалось, характерный для Arthrobacter sp. КМ-P пик с максимальной интенсивностью и m/z 7297-7299 сохраняется при всех условиях культивирования. Обратим внимание, что наибольшее число значимых пиков наблюдается в спектре, полученном для клеток, выращенных на АМП. Эта среда является наиболее бедной из всех трех использованных, в ней единственным источником углерода, азота и энергии для роста бактерий является пиридин. По всей видимости, в связи с этим, клетки штамма максимально активизируют ферментные системы, что приводит к синтезу белков, обладающих деструктивной и каталитической активностью. Для более удобного визуального сравнения на рис. 16 приведена гистограмма, отображающая относительные интенсивности основных пиков МАЛДИ-профилей, полученных для каждой из трех сред. Интересно, что пики, кроме основного пика с m/z 2797, были общими в спектрах клеток Arthrobacter sp. КМ-P и Rh. wratislaviensis KM-P, выращенных на АМП. В МАЛДИ-профилях клеток Arthrobacter sp. КМ-P, культивируемых на органических средах (СА и МПА), отсутствуют.
Рис. 16. Гистограмма, демонстрирующая совпадение пиков при анализе Arthrobacter sp. KM-Р, на различных средах.
Таким образом, вне зависимости от условий культивирования, штамм бактерий может быть успешно идентифицирован с применением МАЛДИ-МС.
5. Исследование путей деградации пиридина е его производных.
Обычно данные о путях метаболизма органического соединения получают при работе с бесклеточными экстрактами, определяя активности соответствующих ферментов. К настоящему времени с использованием такой методологии достаточно хорошо изучен метаболизм бензольного кольца под воздействием бактерий. Деструкция фенолов, например, проходит с образованием пирокатехина, который далее может подвергаться расщеплению в мета- или в орто-положении. Было показано, что ключевыми ферментами биодеградации фенолов являются пирокатехин-1,2- или 2,3-диоксигеназы, которые были выделены и охарактеризованы [Солянникова, 2007]. О реакциях раскрытия пиридинового кольца однозначной информации нет. Это, с одной стороны, обусловлено физико-химическими особенностями азотсодержащего гетероцикла [Джилкрист, 1996], с другой – безуспешностью попыток получить каталитически активные бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридин и его производные. Так как ферменты биодеградации пиридинового кольца не были выделены и охарактеризованы, к настоящему времени нет обоснованных данных о путях деградации этих токсикантов.
Исследования путей деградации этих соединений штаммами актинобактерий проводили в динамике роста их культур. Интермедиаты, накапливаемые в КЖ, были обнаружены и извлечены. Выделенные образцы, состояли, как правило, из смеси веществ, и содержались в малых количествах (мкг). Поэтому идентификацию многих из них удалось осуществить в виде триметилсилилированных производных при использовании хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС).
5.1. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом Аrthrobacter sp. КМ-Р. Из экстракта 1 (щелочного) было выделено вещество, которое присутствовало в КЖ в следовых количествах. Основное количество этого вещества (2-3 мг) было выделено из экстракта 3 (кислого). При анализе методом ВЭЖХ оказалось, что время удерживания (Rf) 2,4-динитрофенилгидразона этого соединения идентично Rf 2,4-ДНФ-гидразона синтетического свидетеля – янтарного полуальдегида (120 сек).
Хроматографирование экстракта 2 (нейтрального) показало присутствие соединения, которое окрашивалось FeCl 2. Оно не соответствовало по значению Rf ни одному гидроксипиридину, что давало основание предположить наличие двух гидроксильных групп в пиридиновом кольце. Хроматомасс-спектральный анализ данного образца доказал наличие в нем нескольких соединений, одно из которых имело м.м. 111 и соответствовало дигидроксипиридину (табл. 7, I).Для разделения этой смеси образец триметилсилилировали и исследовали хроматомасс-спектрометрически. После указанной обработки в образце удалось выявить два соединения: с молекулярными массами 183 и 257.
Масс-спектральный распад первого вещества соответствовал распаду моно-ТМС-производного 2,3-дигидроксипиридина, в котором просилилировался один атом водорода гидроксила (табл. 7, II). Молекулярная масса, а также распад второго соединения указывали на то, что оно является продуктом присоединения воды к молекуле гидроксипиридина в положении С–6 (С–2). Учитывая сравнительно низкую величину времени удерживания (tуд) для этого соединения на хроматограмме (5 мин 39 сек) которая оказалось близко к tуд бис-ТМС-производного (см. далее) 2,6-дигидрокси-пиридина. Наиболее вероятной для этого гидрата гидроксипиридина можно считать структуру 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина (табл. 7, III).
Для выявления структуры дигидроксипиридина был проведен дополнительный анализ КЖ, снятой в середине экспоненциальной фазы роста культуры. С помощью тонкослойной препаративной хроматографии на силикагеле из экстракта 2 был выделен образец, который давал характерное окрашивание с FeCl2. После обработки бистриметилилсилилтрифторацетамидоном образец был исследован хроматомасс-спектрометрически. В нем было обнаружено 5 соединений: два изомера с м.м. 255, соответствующие дигидроксипиридинам, в которых два атома водорода замещены ТМС-группами, соединение с м.м. 167, соответствующее гидроксипиридину и два продукта раскрытия пиридинового кольца с м.м. 161 и 248.
Один из изомеров с м.м 255 с большим значением Rf на хроматограмме (6 мин 38 сек) имел хроматографические характеристики такие же, как у синтетического свидетеля ТМС-производного 2,3-дигидроксииридина (6 мин 40 сек).
Время удерживания второго изомера (5 мин 45 сек) резко отличалось от аналогичной характеристики синтетического ТМС-производного 2,5-дигидрокси-пиридина (7 мин 35 сек). Очень короткое время удерживания для выделенного изомера с м.м. 255 свидетельствовало о высокой пространственной затрудненности его атома, что исключает возможность присутствия 2,5-, 3,4- и 2,4-изомеров. Это позволяет предположить для данного соединения единственно возможную структуру бис-ТМС-производного 2,6-дигидроксипиридина (табл. 7, IV).
Масс-спектр гидросипиридина с м.м. 167 был идентичен спектру ТМС-производного синтетического 3-гидроксипиридина.
Анализ соединения с м.м. 161 позволяет предложить для него структурную формулу 3-амино-2 (либо 3)-гидроксипропионового альдегида в виде моно-ТМС-производного(табл. 7, V). Этот альдегид может образовываться из 2,6-дигидрокси-1,2-дигидро-пиридина при его гидролитическом окислении.
Вещество с м.м. 248 (ТМС-производное) представляет собой, по-видимому, 2-гидроксималоновый полуальдегид. Вероятно, он образуется аналогично предыдущему соединению из 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина в результате его гидролитического дезаминирования (табл. 7, VI).
Таблица 7. Масс-спектры соединений, интермедиатов распада пиридина
(Arthrobacter sp. KM-P)
| Соединения | Структура соединений | m/z | Интенсив-ность в % к максималь-ному пику | Процесс образования фрагмента | |||
| Дигидрокси-пиридин (I) | | 111 109 83 82 71 55 | 12 11 74 29 100 46 | М М–2Н М–СО М–СНО М–С2Н2N М–2СО | |||
| 2,3-дигидрок- сипиридин (моно-ТМС-производное) (II) | | 183 168 155 150 139 112 73 | 30 17 4 5 15 4 100 | М М–СН3 М–СО М–СН3–Н2О М–СН3–СНО М–СН3–СНО–НСN Si(СН3)3 | |||
| 2,6-дигидрок-си-1,2-дигид-ропиридин (бис- ТМС-производное) (III) | | 257 215 185 145 129 103 73 | 30 87 72 100 16 33 72 | М М–СН2–СО (М–(СН3)2SiСН2) = А А–C3H4 А–C2H2NО А–C3H4NCО Si(СН3)3 | |||
| 2,6-дигидро-ксипиридин (бис-ТМС-производное) (IV) | | 255 240 225 156 103 96 73 | 7 10 38 14 58 15 100 | М М–СН3 М–2СН3 М–СНСОSi(СН3)2 СН2ОSi(СН3)3 М–2СН3–Si(СН3)3–2СО Si(СН3)3 | |||
| 3-амино-2-ги-дроксипропи-оновый аль-д (ТМС-произ-водное) (V) | | 161 146 118 116 103 75 73 | 2 80 38 20 65 100 50 | М М–СН3 М–СН3–СО М–СН3– СН2NН2 М–2СН3–СО (СН3)2 SiОН Si(СН3)3 | |||
| 2-гидрокси-малоновый полуаль-д. (ТМС-производное) (VI) | | 248 233 218 205 189 147 117 103 89 73 | 5 2 30 85 40 68 50 20 9 100 | М М–СН3 М–2СН3 М–СН3–СО М–СН3–СО2 (СН3)3SiОSi(СН3)2 СООSi(СН3)3 (СН3)3 SiОСН2 (СН3)3SiО Si(СН3)3 | |||
| 5-амино-2-ок-со-4-пентено-воя к-та (бис-ТМС-произ-водное) (VII) | | 273 258 229 228 214 156 147 117 102 73 | 16 10 6 6 4 62 52 4 4 100 | М М–СН3 М–СН3–СНО М–СН3–СН2О М–СН3–СО2 М–СООSi(СН3)3 (СН3)3 SiОSi(СН3)2 СООSi(СН3)3 СООSi(СН3)2 Si(СН3)3 | |||
| 2,3,6-тригид-рокси-5,6-ди-гидропиридин (VIII) | | 129 111 101 95 84 60 56 45 44 | 86 16 16 28 100 52 82 83 86 | М М–Н2О М–СО М–2ОН М–Н2О–НСN М–СО–СНСО(С2Н6NО) С3Н4О(С2О2) С2 Н5О С2 Н4O | |||
| пигмент азахиноновой природы (IX) | | 369 368 339 313 299 297 284 256 255 239 237 236 213 200 199 185 71 55 | 4 6 2 4 3 3 5 13 5 7 5 7 7 4 5 10 40 100 | М М–Н М–Н–НСО M-2CO М–NС2О2 М–H-HNС2О2 (М–НNСO-NСO )=A (A–CO) = B (М–2HNСO–CО)=B Б–OH B–H2O B–H2O–H (A–HNCO–CO) = Г Б–2СO Б–СO–СНO Г–СО С2НNO2 С2НNO | |||
| бис-ТМС-производное полуамида винной кислоты (X) |
| 293 218 205 191 177 147 133 129 117 103 73 | 3 20 45 5 5 60 8 9 28 31 100 | М М–ОSi(СН3)2 (М–NHSi(СН3)3 )=А М–СН3NSi(СН3)3 М–(СН3)3SiNHCO HOCHCOOSi(СН3)3 A–Si(СН3)2СН2 A–(СН3)2SiНOH COOSi(СН3)3 СН2OSi(СН3)3 Si(СН3)3 | |||
5.2. Превращение 2- и 3-гидроксипиридинов штаммом Arthtrobacter sp. KM–Р.
