Диссертация (Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus), страница 4
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus". Документ из архива "Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой докторскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук.
Онлайн просмотр документа "Диссертация"
Текст 4 страницы из документа "Диссертация"
Полученные результаты по данным сохранения жизнеспособности клеток, так и их утилизирующей активности не позволили отдать предпочтение какой-либо из сред для длительного хранения штамма Arthrobacter sp. KM-4.
3.2. Тест на «ускоренное хранение» лиофилизированных клеток штамма бактерий Arthrobacter sp. KM-4. С целью определения гарантированного времени сохранности штамма при 4оС и быстрой оценки эффективности использованных сред проводили «тест на ускоренное хранение». Для этого ампулы с лиофилизированными клетками в течение месяца хранили при 4о, 28о и 37оС, после чего оценивали как жизнеспособность бактерий, так и их утилизирующую активность (таблицы 3 и 4).
Таблица 3. Результаты «теста на ускоренное хранение» лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4 на различных защитных средах
| Защитная среда | Температура хранения, оС | Титр жизнеспособных клеток | |||
| до консер-вацииYо | 1 сутки | 15 суток | 30 суток | ||
| Y1 | Y2 | Y3 | |||
| 5% трегалоза | 4 28 37 | 8,34 | 7,60 7,60 7,60 | 7,50 7,47 7,30 | 7,49 7,41 7,00 |
| Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита | 4 28 37 | 8,47 | 7,60 7,60 7,60 | 7,60 7,60 7,60 | 7,59 7,69 7,67 |
| Сухое молоко | 4 28 37 | 9,32 | 8,77 8,77 8,77 | 8,77 8,77 8,77 | 8,47 8,74 8,36 |
Динамика титра жизнеспособных клеток представлена на рисунке 11, a, b, c.
Рис. 11. Жизнеспособность Аrthrobacter sp. KM-4 по результатам «теста на ускоренное хранение» в: а) лошадиной сыворотке с 5% раствором мезо-инозита (46 лет); b) 5% раствор трегалозы (4 года); c) сухом молоке (5 лет).
Из их анализа следует, что на лошадиной сыворотке с 5% раствором мезо-инозита титр жизнеспособных клеток снизится до ~ 102 кл/мл за 46 лет (а); 5% растворе трегалозы – за 4 года (b); на сухом молоке – за 5 лет хранения (с).
Прогнозирование выживаемости лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4, основанное на «тесте ускоренного хранения», базируется на следующих теоретических положениях. Первое состоит в том, что скорость снижения выживаемости лиофилизированных клеток подчиняется уравнению кинетики 1-го порядка. Отсюда зависимость выживаемости от времени хранения при постоянной температуре носит экспоненциальный характер. Второе теоретическое положение основано на использовании уравнения Аррениуса при описании зависимости константы скорости К от температуры хранения. Результаты расчетов коэффициента К уравнения Аррениуса согласно [Banno, Sakane, 1981; Griffin et al., 1981] представлены на рисунке 11.
Рис. 11. Расчет коэффициента К уравнения Аррениуса [Banno, Sakane, 1981, Griffin, et al.,1981].
Как видно из рисунка, экспериментальные значения lg К=f (I/Т·103), соответствующие использованным нами температурам 4о, 28о и 37оС, легли на одну прямую, что подтверждает возможность применения теста для прогнозирования возможного времени хранения лиофилизированной культуры.
Оценка утилизирующей активности лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4 после хранения при разных температурах (4о, 28о и 37оС) показала, что при использовании всех защитных сред и разных температурных значений способность утилизировать 2,6-ДМП сохранялась на высоком уровне (табл. 4).
Таблица 4. Результаты «теста на ускоренное хранение» лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4 в различных защитных средах (утилизация 2,6-ДМП)
| Защитная среда, | Температура хранения, 0С | до консер-вации % | Утилизирующая активность* в % | ||
| 1 сутки | 15 суток | 30 суток | |||
| 5% раствор трегалозы | 4 28 37 | 100 100 100 | 94-97 88-91 85-88 | 94-98 85-89 82-86 | 94-96 83-85 74-78 |
| Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита | 4 28 37 | 100 100 100 | 95-97 93-96 89-92 | 94-97 92-96 87-90 | 94-97 90-95 84-89 |
| Таблетка сухого молока | 4 28 37 | 100 100 100 | 96-97 91-94 83-88 | 95-97 87-92 80-85 | 95-97 81-84 76-79 |
*Примечание: за 100% утилизирующую активность принята утилизация штаммом Arthrobacter sp. KM-4 3,0 г/л 2,6-диметилпиридина за 24 часа
3.3. Криоконсервация. Криоконсервация в настоящее время является наиболее перспективным методом длительного хранения коллекционных штаммов микроорга-низмов [Shannon, et al., 1975, Calcott, 1978, Пучков и др., 1983, Пушкарь и др., 1983].
Для криоконсервации штамма Arthrobacter sp. KM-4 в качестве криопротекторов были выбраны: 10% раствор глицерина; 12% раствор сахарозы; 5% раствор трегалозы и лошадиная сыворотка с 5% раствором мезо-инозита (табл. 5).
Таблица 5. Жизнеспособность штамма Arthrobacter sp. KM-4 при криоконсервации
| Криопротектор | Количество жизнеспособных клеток в % при хранении | ||||||||
| Y0 | 1 сутки | 1 месяц | 6 месяцев | 9 месяцев | |||||
| Y1 | % | Y3 | % | Y4 | % | Y5 | % | ||
| 5% трегалоза 10% глицерин 12% сахароза Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита | 8,46 8,30 9,60 8,30 | 7,90 7,90 8,47 7,60 | 27 40 10 20 | 7,84 7,84 7,60 7,60 | 24 35 1,0 20 | 7,78 7,84 7,47 7,60 | 20 35 0,75 20 | – 7,84 7,47 7,60 | – 35 0,75 20 |
Наиболее высокий титр жизнеспособных клеток ~ 40% от исходного, был получен при использовании 10% глицерина: жизнеспособность клеток за 9 месяцев хранения снизилась только на 5%. Эти данные согласуются с имеющиеся в литературе (Аркадьева, 1983) сведениями о том, что глицерин является одним из универсальных криопротекторов. Наиболее низкое значение жизнеспособности ~10% от исходного, было получено при использовании 12% сахарозы: за время хранения наблюдалось резкое падение титра жизнеспособных клеток до ~ 0,75%. В вариантах криоконсервации Arthrobacter sp. KM-4 в 5% трегалозы, а также лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита титр жизнеспособных клеток сразу после консервации был значительно ниже, чем при использовании глицерина. Однако в лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита за 9 месяцев хранения жизнеспособность не снижалась и составила ~ 20%, как и сразу после криоконсервации. За это же время при использовании 5% трегалозы наблюдалось снижение жизнеспособности с ~ 27 до ~ 20%(табл. 5).
Утилизирующая активность штамма Arthrobacter sp. KM-4 после криоконсервации сохранялась на высоком уровне при использовании лошадиной сыворотки с 5% мезо-инозита и была равна 100%, тогда как на остальных криопротекторах наблюдалось некоторое снижение активности (табл. 6).
Таблица 6. Утилизация 2,6-диметилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. KM-4
| криопротектор | Активность* клеток штамма в % при хранении | ||||
| 1 сутки | 15 суток | 30 суток | 6 месяцев | 9 месяцев | |
| 5% трегалоза 10% глицерин 12% сахароза Лошадиная сыворотка с 5% мезо-инозита | 94 – 97 95 – 98 95 – 98 100 | – – – – | 85 – 89 87 – 90 73 – 80 100 | 63 – 67 87 – 90 87 – 89 100 | – 96 – 98 85– 87 100 |
*Примечание: за 100% утилизирующую активность принята утилизация штаммом Arthrobacter sp. KM-4 3,0 г/л 2,6-диметилпиридина за 24 часа
