Диссертация (Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus), страница 2

Практическое значение работы. Из почв, длительное время подвергавшихся воздействию пиридина и его производных, выделены штаммы бактерий родов Аrthrobacter и Rhodococcus, которые способны разлагать устойчивые азотсодержащие поллютанты – незамещенный пиридин, 2-метил-, 4-метил-, 2,4-диметил- и 2,6-диметил-пиридины. Создана коллекция штаммов бактерий, адаптированных к высоким концентрациям токсикантов и характеризующихся высокой скоростью их разложения. Штамм Аrthrobacter sp. КМ-4 за 24 часа утилизировали 2,5 г/л пиридина и 2-МП, 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП. Варианты штамма, утилизирующие: пиридин – Аrthrobacter sp. КМ-Р; 2-метилпиридин – Аrthrobacter sp. КМ-2МР; 4-метилпиридин – Аrthrobacter sp. КМ-4МР и 2,6-ДМП – Аrthrobacter sp. КМ-2.6DMP.

Штамм Rhodococcus wratislaviensis KM-P за 24 часа утилизировал 2,5 г/л пиридина, Rhodococcus erythropolis 2.4DMP – 2,0 г/л 2,4-диметилпиридина в течение 36 часов. Штаммы утилизировали пиридин и его производные до СО₂ и Н₂О. Аrthrobacter sp. КМ-4 депонирован в ВКМ (Ас-1098Д).

Лабораторные испытания по биодеградации пиридиновых оснований, содержащихся в сточных водах коксохимического производства с помощью бактерий Аrthrobacter sp. КМ-4 показали их высокую деструктивную активность: снижение концентрации пиридинов с 75–90 мг/л до 8–15 мг/л в течение 6 часов.

Штаммы Rhodococcus wratislaviensis KM-P и Rh. erythropolis 2.4DMP утилизирующие пиридин и 2,4-диметилпиридин рекомендованы для очистки промышленных сточных вод коксохимической и химико-фармацевтической отраслей промышленности.

Материалы диссертационной работы используются в лекционной работе профессорско-преподавательским составом ВУЗов КБР.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы представлены и обсуждались на 4-м Европейском конгрессе по биотехнологии (Амстердам, Голландия, 1987); на конференции «Охрана окружающей среды» (Братислава, Чехословакия, 1988); на 8-м Международном симпозиуме по биотехнологии (Париж, Франция, 1988); на 3-м Симпозиуме актиномицетологов (Будапешт, Венгрия, 1988); на 5-м Международном конгрессе по коллекциям культур (Вашингтон, США, 1988); на 2-м Международном симпозиуме по микробиологии (Киото, Япония, 1989); на 3-м Съезде ВМСО и всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007); на Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); на Международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ» (Москва, 2008); на 56-ом съезде по масс-спектрометрии (Денвер, США, 2008); на 3-м Европейском конгрессе по микробиологии (Гётеборг, Швеция, 2009); на 18-ой Международной конференции по масс-спектрометрии (Бремен, Германия, 2009), на 3-ей Международной конференции "Химия гетероциклических соединений" (Москва, 2010).

Защищаемые положения диссертации.

• Представители немицелиальных актинобактерий из р.р. Аrthrobacter и Rhodococcus обладают высокой деградативной способностью в отношении широкого спектра пиридиновых токсикантов.

• Широкая субстратная толерантность, свойственная исходному выделенному из природных образцов штамму, восстановлена после хранения в виде спектра выщипившихся диссоциантов, высокоактивных в отношении отдельных субстратов.

• Бактерии-деструкторы, утилизирующие пиридин и его производные и не способные расти на их индивидуальных интермедиатах разложения пиридина, могут индуцироваться исходным субстратом (пиридином).

• Первой стадией разложения пиридина и его производных актинобактериями р.р. Аrthrobacter и Rhodococcus могут быть не только восстановление, но окисление гетероцикла, аналогично начальному этапу окисления ароматического кольца при биодеструкции замещенных фенолов.

• Разрыв окисленного кольца пиридина может идти по нескольким путям: орто-, мета- или между C-N, аналогично многочисленным путям разрушения ароматического кольца у замещенных фенолов. Дальнейшие превращения окисленных пиридинов могут осуществляться по нескольким независимым путям.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 35 работ, из них 14 экспериментальных статей в рекомендуемых ВАК`ом изданиях, 1 патент, тезисы 15 докладов.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 236 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов, списка цитируемой литературы, который включает 327 источников, содержит 27 таблицы и 40 рисунков.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам кафедры микробиологии биологического и лаборатории органического анализа химического факультетов МГУ им. М.В. Ломоносова оказавшим помощь и поддержку на всех этапах выполнения представленной работы. Автор признателен научным консультантам настоящей работы профессору Александру Ивановичу Нетрусову (Биологический ф-т, МГУ, зав. каф. микробиологии) и профессору Альберту Тарасовичу Лебедеву (Химический ф-т, МГУ, зав. лабораторией масс-спектрального анализа) за внимание и постоянный интерес к работе, а также за помощь в обсуждении результатов работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В обзоре описаны основные пути микробной деструкции соединений, содержащих пиридиновое кольцо, с помощью микроорганизмов, также обобщены данные о применении метода МАЛДИ для масс-спектральной характеристики сапротрофных групп микроорганизмов по белковым профилям.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Используемые реактивы были аналитической чистоты. В качестве субстратов для деградации использовали свежеперегнанные препараты незамещенного пиридина; 2-метил- и 4-метилпиридина; 2,4- и 2,6-диметилпиридина. Чистота реактивов после перегонки составила 98% (данные ГХ-МС). В качестве соединений «свидетелей» использовали коммерческие препараты 6-гидрокси-2-метилпиридина и 5-гидрокси-2-метилпиридина. Соединения: 3-гидрокси-2,6-диметилпиридин; 4-гидрокси-2,6-диметил-пиридин; 3,4-дигидрокси-2,6-диметилпиридин; 3-гидрокси-2-метилпиридин; 2-гидрок-си-4-метилпиридин; 2,3-дигидрокси-4-метилпиридин; N-ацетилпиррол; N-формил-2-метилпиррол – были синтезированы.

Микроорганизмы. Штаммы бактерий выделяли из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» (г. Купавна, Московская обл.) и Авдеевского коксохимического завода (г. Авдеевка, Украина) по синтезу легких пиридинов, длительно подвергавшихся воздействию пиридинов в сточных водах. Выделение бактерий проводили методом накопительных культур на жидкой синтетической среде Шуклы [Shukla, 1973]., культивировали в колбах 750мл с 200 мл среды, на качалке (200 об/мин) при 28-30⁰С. Пересевы производили до появления видимого роста микроорганизмов, с каждым разом увеличивая концентрацию вносимого субстрата. После нескольких пересевов, источник азота в виде (NH₄)₂SO₄ исключали. Чистые культуры получали по методу Коха [Нетрусов, 2005]. Морфологические особенности штаммов изучали с помощью микроскопии, используя иммерсионную систему, фазово-контрастное устройство и электронно-микроскопическую технику (Hitachi-S-405A). Идентификацию штаммов проводили согласно Берджи [Bergey’s, 1986].

Секвенирование последовательности гена 16S рРНК. ДНК из клеток бактерий выделяли по методу [Булыгина, 2002]. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием системы универсальных праймеров [Edwards, 1989]. Состав реакционной смеси для ПЦР: праймеры по 25 пмоль, каждого; 10 × буфер – 2,5 мкл; 2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата – 2,5 мкл; Bio Taq-полимераза 5Е/мкл – 0,2 мкл («Диалат», Москва); ДНК-матрица – 50 нг; Н₂О – до 25 мкл. Реакцию проводили по схеме: до 30 циклов амплификации при следующем температурном режиме: денатурация ДНК при 94^оС – 0,5 мин; отжиг праймеров при 45^оС – 1 мин; элонгация при 72^оС – 1 мин; окончательная полимеризация – 7 мин. Продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Использовали систему видеодокументации BioDocII (Biometra, Германия). Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США). Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора реактивов Silver Sequencing, (Promega, США), согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Для сиквенирования использовали как внешние, так и внутренние праймеры. Чтение проводили в двух направлениях.

Первичный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью сервера BLASTA, и выравнивание последовательностей – с помощью программы CLUSTAL.W [Thompson, 1994]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий проводили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer, 1994].

Количественные определения потребления пиридинов из культуральной жидкости (КЖ) проводили на спектрофотометре «Hitachi-200-20» (Япония) при следующих длинах волн: 255 нм для пиридина (П); 262 нм для 2-метилпиридина (2-МП) и 4-метилпиридина (4-МП); 260 нм для 2,4-диметилпиридина (2,4-ДМП); 268 нм для 2,6-диметилпиридина (2,6-ДМП). Для этого культуру подкисляли HCl, отделяли клетки центрифугированием, 1 мл супернатанта доводили до 100 мл 0,1 н раствором HCl и определяли величину оптической плотности. Калибровочную кривую строили по анализируемым субстратам.

Хранение исходного штамма Arthrobacter sp. KM-4. Лиофилизацию клеток осуществляли на центробежно-сублимационной установке (Edvards High Vacuum Company, Англия). Высушивание – 3 часа на первичной сушке 3ОРI при остаточном ваккуме 110 мм рт.ст., t рефрижератора – 45^оС и t сублиматора – 22^оС. Ампулы с клетками с остаточной влажностью 2,0-3,0 %, запаивались под ваккумом и хранились при 4^оС без доступа света [Герна, 1983]. Тест на «ускоренное хранение» проводили по методу [Banno, Sakane, 1981]. Криоконсервацию суспензии клеток проводили ультрабыстрым способом со скоростью охлаждения ~ 400 град/мин путем непосредственного погружения в жидкий азот и последующим хранением при –196^оС.

Определение потребления пиридина суспензией и иммобилизованными клетками Аrthrobacter sp. KM-P Скорость утилизации пиридина оценивали суспензией свободных и иммобилизованных в альгинате кальция клеток на среде следующего состава (г/л): KH₂PO₄ – 0,2; MgSO₄·7H₂O – 0,2; FeSO₄·7H₂O – 0,01; CaCl₂·2H₂O – 0,02; MnSO₄·H₂O – 0,002; Na₂MoO₄ – 0,001; pH 7,0-7,2.В колбы Эрленмейера с 200 мл среды вносили пиридин, в концентрациях по 1,5, 2,5, 3,0 и 3,4 г/л. В каждую из колб ввели по 8,3 мл суспензии клеток и по 25 мл гранул с клетками и культивировали при аэрации и 28^о-30^оС. Пробы на предмет утилизации 1,5 г/л пиридина отбирали через каждые 3 часа и через каждые 6 часов для остальных концентраций.

Выделение и идентификация индивидуальных продуктов деградации пиридинов. Экстракты 1-3, полученные при рН 8,0-9,0; 7,0-7,5 и 2,0-3,0 из 1-2 л КЖ, упаривали, остаток растворяли в 0,5-1,0 мл этанола и проводили разделительную хроматографию на пластинках “Silufol UV - 254” (DC-Alufolies Kieselgel 60 F_254, Merck, Германия) и пластинках с целлюлозой (TLC-Ready Plastic Sheets F_1440, Merck, Германия). Использовали следующие системы растворителей 1 – хлороформ-метанол (20:3); 2 – хлороформ-ацетон-этанол (7:2:2); 3 – этанол-аммиак-вода (20:1:4); 4 – петролейный эфир-этилацетат (1:5). Хроматограммы проявляли в УФ-свете или парами йода. Фенольные соединения – опрыскивая хроматограммы 2% спиртовым раствором FeCl₂; кетокислоты – 0,5% раствором 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ) в 2 н растворе HCl; карбоновые кислоты – 0,05% спиртовым раствором бромкрезолового зеленого (рН 7,0-8,0). Для препаративного выделения индивидуальных продуктов использовали тонкослойную и колоночную хроматографию. В первом случае экстракты, растворенные в этаноле, хроматографировали на силикагеле (PSC- Fertigplatten Kieselgel 60 F_254, Merck, Германия), используя системы растворителей 1, 2 и 3. Хроматографические зоны сорбента вырезали и элюировали этанолом, полученные растворы фильтровали, фильтраты упаривали, осадок анализировали.

Для препаративного выделения карбоновых кислот использовали колоночную хроматографию (30х1,7) на целлюлозе (Silicagel L 40/100, Chemapol, CzSR) в системе растворителя 3, а также тонкослойную препаративную хроматографию в системах растворителей 2, 3 и 4. Структуру выделенных индивидуальных соединений доказывали анализом их масс-, УФ-, ИК- и ЯМР-спектров. 2,4-динитрофенилгидразоны кетокислот получали путем обработки образцов раствором 2,4-ДНФГ в хлорной кислоте с последующим разделением в тонком слое силикагеля, в системе петролейный эфир-этилацетат-уксусная кислота (26:14:3).

Триметилсилилирование полученных образцов проводили по методу, описанному в [Gehrke, Laking, 1971]: к исследуемому образцу добавляли 25 мкл ацетонитрила, 25 мкл дихлорэтана и 50 мкл бистриметилсилилтрифторацетамида (Regisil BSTFA), смесь выдерживали 30 мин при 150-160^оС.

Хроматомасс-спектральный анализ проводили на приборе «Varian-MAT-211» со стеклянной капиллярной колонкой (50м x 0,2 мм) с неподвижной фазой SE-30. Масс-спектры получали на приборе « Finigan МАТ-4615» методом химической ионизации (газ-реагент NН₃) при энергии ионизации 70 эВ с прямым вводом вещества в ионный источник. Спектры ЯМР ¹Н сняты на спектрометре «Tesla BS-467» в растворе СDСl₃, внутренний стандарт – тетраметилсилан (ТМС).

Выделение и идентификация продуктов деградации 2-МП Пробы отбирали в динамике роста культуры в объеме 200 мл, подкисляли до рН 2,0-3,0 HCl, клетки отделяли центрифугированием, 30 мл супернатанта трижды экстрагировали 10 мл свежеперегнанного дихлорметана. Суммарную кислотную дихлорметановую вытяжку (~30 мл) упаривали на роторном испарителе до объема ~3 мл (экстракт 1). Оставшийся водный раствор подщелачивали до рН 8,0-9,0 40% раствором NаOH, после чего трижды экстрагировали 10 мл дихлорметана. Суммарную вытяжку упаривали до объема ~3 мл (экстракт 2). Для получения дериватизированных экстрактов 30 мл КЖ упаривали досуха на роторном испарителе, сухой остаток растворяли в 2 мл дихлорметана, в полученный раствор добавляли 1 мл раствора BF₃ в метаноле, кипятили 2 мин и трижды промывали дистиллированной водой. Конечный объем составлял ~3 мл (экстракт 3). Аналогичным образом была проведена дериватизация кислотного экстракта (экстракта 1), к которому добавляли 1 мл раствора BF₃ в метаноле и кипятили 2 мин, после чего экстракт трижды промывали дистиллированной водой, упаривали до конечного объема 3 мл (экстракт 4). Силилирование продуктов деградации 2-МП из экстрактов КЖ проводили N,O-бис(триметилсилил)-ацетамидом. К 1 мл экстракта добавляли 10 мкл силилируещего агента. Процесс проводили в ультразвуковой бане в течение 2 часов при 60^оС. Затем аликвоту объемом 100 мкл доводили дихлорметаном до 1 мл. Анализ продуктов, содержащихся в экстрактах, проводили на масс-спектрометре ГХ-МС (LECO Pegasus 4D, Германия), снабженном капиллярной силиконовой колонкой RTX-5MS (30 м), при энергии ионизующих электронов 70 эВ. Диапазон регистрируемых масс – от 29 до 500 Да. Экстракты хроматографировали в температурном режиме: 2 мин при 50^oС, 2 мин при 280^оС, скорость нагрева – 20^оС/мин. Объем вводимой пробы – 0,1 мкл. Компоненты анализируемых смесей идентифицировали с помощью компьютерных библиотек масс-спектров органических соединений: 1) NIST - National Institute of Science and Technology, библиотека на 130 тысяч соединений; 2) WILEY-библиотека на 275 тысяч соединений, а также вручную с использованием известных направлений распада молекулярных ионов органических соединений [Лебедев, 2003].