CBRR2757 (Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди)

9

ÎÃËÀÂËÅÍÈÅ

ÑÏÈÑÎÊ ÑÎÊÐÀÙÅÍÈÉ..............................................................................................3

ÂÂÅÄÅÍÈÅ.............................................................................................................................4

ÎÁÇÎÐ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ......................................................................................................5

ÑÒÐÎÅÍÈÅ ÈÌÌÓÍÎÃËÎÁÓËÈÍÎÂ...................................................................................5

ÃÅÍÎÌÍÀß ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈß È ÝÊÑÏÐÅÑÑÈß

ÃÅÍÎÂ L-ÖÅÏÅÉ ÈÃ Ó ÌËÅÊÎÏÈÒÀÞÙÈÕ....................................................................7

ÃÅÍÎÌÍÀß ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈß È ÝÊÑÏÐÅÑÑÈß

ÃÅÍΠL-ÖÅÏÅÉ ÈÃ Ó ÍÈÇØÈÕ ÏÎÇÂÎÍÎ×ÍÛÕ......................................................11

ÝÂÎËÞÖÈß ÃÅÍÎÂ L-ÖÅÏÅÉ ÈÃ.......................................................................................19

ÌÀÒÅÐÈÀËÛ È ÌÅÒÎÄÛ...........................................................................................24

ÝËÅÊÒÐÎÔÎÐÅÇ ÄÍÊ............................................................................................................24

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÄÍÊ ÈÇ ÃÅËß.................................................................................................24

ÏÎËÓ×ÅÍÈÅ ÐÀÄÈÎÀÊÒÈÂÍÛÕ ÇÎÍÄÎÂ......................................................................25

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ ÄÍÊ......................................................................................26

Î×ÈÑÒÊÀ ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ ÄÍÊ ÌÅÒÎÄÎÌ ÐÀÂÍÎÂÅÑÍÎÃÎ

ÖÅÍÒÐÈÔÓÃÈÐÎÂÀÍÈß Â ÃÐÀÄÈÅÍÒÅ ÏËÎÒÍÎÑÒÈ CsCl........................................26

ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÀÖÈß ÏÐÎÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÊËÅÒÎÊ...................................................27

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ ÈÇ ÊÐÎÂÈ ÐÛÁ.................................................................28

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÑÓÌÌÀÐÍÎÉ ÐÍÊ ÈÇ ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ.....................................................28

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÂÛÑÎÊÎÌÎËÅÊÓËßÐÍÎÉ ÄÍÊ

ÈÇ ÝÓÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÊËÅÒÎÊ.....................................................................................28

ÊÎÍÑÒÐÓÈÐÎÂÀÍÈÅ ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ......................................................................29

ÏÎËÈÌÅÐÀÇÍÀß ÖÅÏÍÀß ÐÅÀÊÖÈß...............................................................................33

ÑÓÁÊËÎÍÈÐÎÂÀÍÈÅ ÄÍÊ...................................................................................................34

ÑÊÐÈÍÈÍà ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ........................................................................................34

ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÍÓÊËÅÎÒÈÄÍÎÉ ÏÎÑËÅÄÎÂÀÒÅËÜÍÎÑÒÈ ÄÍÊ.............................35

ÑÀÓÇÅÐÍ ÁËÎÒ ÃÈÁÐÈÄÈÇÀÖÈß.....................................................................................36

ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ.....................................................................................................................38

ÊÎÍÑÒÐÓÈÐÎÂÀÍÈÅ ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ È ÅÅ ÑÊÐÈÍÈÍÃ.....................................38

ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÏÅÐÂÈ×ÍÎÉ ÑÒÐÓÊÒÓÐÛ......................................................................40

ÑÐÀÂÍÈÒÅËÜÍÛÉ ÀÍÀËÈÇ ÏÅÐÂÈ×ÍÎÉ ÑÒÐÓÊÒÓÐÛ..............................................40

ÀÍÀËÈÇ ÃÅÍÎÌÍÎÉ ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈÈ..............................................................................41

ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ....................................................................................................................46

ÂÛÂÎÄÛ...............................................................................................................................48

ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ................................................................................................49

ÑÏÈÑÎÊ ÑÎÊÐÀÙÅÍÈÉ

ÈÃ èììóíîãëîáóëèíû

ïí ïàð íóêëåîòèäîâ

òïí òûñÿ÷ ïàð íóêëåîòèäîâ

å.à. åäèíèöà àêòèâíîñòè

ÈÏÒÃ èçîïðîïèëòèîãàëàêòîçèä

ÒÅÌÅÄ N,N,N,'N'-òåòðàìåòèë-ýòèëåí-äèàìèí

òðèñ òðèñ(ãèäðîêñèìåòèë)àìèíîìåòàí

äÍTÔ äåçîêñèàäåíîçèíòðèôîñôàò

ääÍÒÔ äèäåçîêñèíåêëåîòèäòðèôîñôàò

äÍÒÔ äåçîêñèíóêëåîòèäòðèôîñôàò

ðATÔ ðèáîàäåíîçèíòðèôîñôàò

ÄÒÒ äèòèîòðåéòîë

Na₂ÝÄÒÀ ýòèëåíäèàìèíòåòðààöåòàò íàòðèÿ

SDS äîäåöèëñóëüôàò íàòðèÿ

X-Gal 5-áðîìî-4-õëîðî-3-èíäîëèë-áåòà-D-ãàëàêòîçèä

ÂÂÅÄÅÍÈÅ

 îñíîâå ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ãóìîðàëüíîãî èììóíèòåòà ó ìëåêîïèòàþùèõ ëåæèò ñëîæíûé êîìïëåêñ ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêèõ è ôèçèîëîãè÷åñêèõ ìåõàíèçìîâ, îáåñïå÷èâàþùèõ ðåîðãàíèçàöèþ, ìóòàãåíåç è êëîíàëüíóþ ýêñïðåññèþ ãåíîâ èììóíîãëîáóëèíîâ. Âîçíèêíîâåíèå ýòîé ïîäñèñòåìû èììóíèòåòà ñâÿçûâàþò ñ ïîÿâëåíèåì õðÿùåâûõ ðûá.

Íà ðàííèõ ýòàïàõ ýâîëþöèè ãåíû Èà áûëè îðãàíèçîâàíû â âèäå ïîâòîðÿþùèõñÿ êëàñòåðîâ V-J-C ãåííûõ ñåãìåíòîâ. Ïðè ïîäîáíîé îðãàíèçàöèè ðàçíîîáðàçèå ïðîäóöèðóåìûõ àíòèòåë îñíîâûâàëîñü, ïðåæäå âñåãî, íà êîëè÷åñòâå èìåâøèõñÿ â ãåíîìå êëàñòåðîâ, êàæäûé èç êîòîðûõ êîäèðîâàë îäèí âàðèàíò ïîëèïåïòèäíûõ ñóáúåäèíèö ÈÃ.  õîäå äàëüíåéøåé ýâîëþöèè ïðîèçîøåë ïåðåõîä îò êëàñòåðíîé ê ñåãìåíòàðíîé îðãàíèçàöèè, îáåñïå÷èâàþùåé äîïîëíèòåëüíûé èñòî÷íèê ðàçíîîáðàçèÿ çà ñ÷åò êîìáèíàòèâíîé ðåêîìáèíàöèè ãåííûõ ñåãìåíòîâ. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî ýòîò ïåðåõîä òàêæå èìåë âàæíîå çíà÷åíèå äëÿ ðåãóëÿöèè ýêñïðåññèè ãåíîâ è îñóùåñòâëåíèÿ ìåõàíèçìîâ êëîíàëüíîãî îòáîðà àíòèòåëîïðîäóöèðóþùèõ êëåòîê â õîäå èììóííîãî îòâåòà.

Íàñòîÿùàÿ ðàáîòà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ÷àñòü ïðîåêòà, íàïðàâëåííîãî íà èçó÷åíèå ýâîëþöèè ìåõàíèçìîâ èçîòèïè÷åñêîãî èñêëþ÷åíèÿ ãåíîâ ëåãêèõ öåïåé Èà ó íèçøèõ ïîçâîíî÷íûõ. Öåëÿìè ðàáîòû ÿâëÿëèñü èçó÷åíèå ñòðóêòóðû è îðãàíèçàöèè ãåíîâ ëåãêèõ öåïåé Èà ñòåðëÿäè (Acipenser ruthenus), ïðåäñòàâèòåëÿ ôèëîãåíåòè÷åñêè äðåâíåé ãðóïïû êîñòíî-õðÿùåâûõ ðûá.

ÎÁÇÎÐ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ

ÑÒÐÎÅÍÈÅ ÈÌÌÓÍÎÃËÎÁÓËÈÍÎÂ

Èììóíîãëîáóëèíû âûïîëíÿþò â îðãàíèçìå ïîçâîíî÷íûõ ôóíêöèþ ãóìîðàëüíûõ àíòèòåë è àíòèãåí-ñâÿçûâàþùèõ ðåöåïòîðîâ Â-ëèìôîöèòîâ. Îñîáåííîñòüþ ýòîãî êëàññà áåëêîâ ÿâëÿåòñÿ îãðîìíîå ðàçíîîáðàçèå, ïîçâîëÿþùåå èì âñòóïàòü âî âçàèìîäåéñòâèå ñ ôàêòè÷åñêè ëþáûìè áèîëîãè÷åñêèìè ìàêðîìîëåêóëàìè.

Òèïè÷íàÿ ìîëåêóëà Èà ñîñòîèò èç äâóõ èäåíòè÷íûõ òÿæåëûõ (H) è äâóõ èäåíòè÷íûõ ëåãêèõ (L) ïîëèïåïòèäíûõ öåïåé. H- è L-öåïè ïîñòðîåíû èç íåñêîëüêèõ äîìåíîâ, êàæäûé èç êîòîðûõ ñîñòîèò ïðèìåðíî èç 110 àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêîâ. Ó ìëåêîïèòàþùèõ ñóùåñòâóåò ïÿòü êëàññîâ H-öåïåé: g, m, a, d, è e. Êàæäàÿ H-öåïü ïîñòðîåíà èç îäíîãî N-êîíöåâîãî è íåñêîëüêèõ (òðåõ èëè ÷åòûðåõ) C-êîíöåâûõ äîìåíîâ. N-êîíöåâûå äîìåíû ðàçëè÷àþòñÿ â ðàçíûõ ìîëåêóëàõ è íàçûâàþòñÿ âàðèàáåëüíûìè (V) äîìåíàìè. C-êîíöåâûå äîìåíû èìåþò îäèíàêîâóþ ñòðóêòóðó ó ìîëåêóë îäíîãî êëàññà è íàçûâàþòñÿ êîíñòàíòíûìè (Ñ) äîìåíàìè (ðèñ. 1) (Ïîë, 1987).

Ñðåäè L-öåïåé ìëåêîïèòàþùèõ ðàçëè÷àþò äâà òèïà: ëÿìáäà è êàïïà. Êàæäàÿ L-öåïü ñîñòîèò èç îäíîãî âàðèàáåëüíîãî è îäíîãî êîíñòàíòíîãî äîìåíîâ.  èíäèâèäóàëüíîé ìîëåêóëå Èà ïðèñóòñòâóåò òîëüêî îäèí òèï L-öåïè (Roitt et al., 1993).

Ãèãàíòñêîå ðàçíîîáðàçèå Èà îáåñïå÷èâàåòñÿ ïðåæäå âñåãî òåì, ÷òî V è C îáëàñòè êîäèðóþòñÿ ðàçíûìè ãåíàìè (ãåííûìè ñåãìåíòàìè), ôèçè÷åñêè ðàçíåñåííûìè â çàðîäûøåâîé ÄÍÊ.

 ôîðìèðîâàíèè âàðèàáåëüíûõ äîìåíîâ H-öåïåé ó÷àñòâóþò òðè ãåííûõ ñåãìåíòà: âàðèàáåëüíûé (V), D-ñåãìåíò (îò àíãë. diversity- ðàçíîîáðàçèå) è J-ñåãìåíò (îò àíãë. joining- ñîåäèíÿþùèé). Ñ-îáëàñòè Í-öåïåé ðàçíûõ êëàññîâ êîäèðóþòñÿ îòäåëüíûìè ãåíàìè (Roitt et al., 1993).

Ðèñ. 1. Ñõåìà ñòðîåíèÿ ìîëåêóëû èììóíîãëîáóëèíà.

Òèïè÷íàÿ ìîëåêóëà èììóíîãëîáóëèíà ñîäåðæèò äâå èäåíòè÷íûå ëåãêèå (L) è äâå èäåíòè÷íûå òÿæåëûå (H) öåïè, ñâÿçàííûå ìåæäó ñîáîé êîâàëåíòíî äèñóëüôèäíûìè ñâÿçÿìè. Êàæäàÿ L-öåïü ñîñòîèò èç îäíîãî âàðèàáåëüíîãî (V_L) è îäíîãî êîíñòàíòíîãî (Ñ_L) äîìåíà. Í-öåïü ñîñòîèò èç îäíîãî V_H è íåñêîëüêèõ C_Í äîìåíîâ.

 ôîðìèðîâàíèè çðåëîãî ãåíà L-öåïè ó÷àñòâóþò òðè ãåííûõ ñåãìåíòà: V-ñåãìåíò è J-ñåãìåíò êîäèðóþò V-äîìåí, C-ñåãìåíò êîäèðóåò êîíñòàíòíûé äîìåí. Íà ïîçäíèõ ñòàäèÿõ ðàçâèòèÿ Â-ëèìôîöèòà ãåííûå ñåãìåíòû, êîäèðóþùèå âàðèàáåëüíûå äîìåíû, îáúåäèíÿþòñÿ â ðàçëè÷íûõ ñî÷åòàíèÿõ, îáðàçóÿ ìàòðèöó äëÿ ýêñïðåññèè L- è H-öåïåé (Seidman et al., 1979; Durdik et al., 1984).

ÃÅÍÎÌÍÀß ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈß È ÝÊÑÏÐÅÑÑÈß ÃÅÍÎÂ L-ÖÅÏÅÉ ÈÃ Ó ÌËÅÊÎÏÈÒÀÞÙÈÕ

Ðàçëè÷íûå âèäû ìëåêîïèòàþùèõ èìåþò ñõîäíóþ ñõåìó îðãàíèçàöèè è ýêñïðåññèè ãåíîâ ÈÃ. Îäíèì èç íàèáîëåå èçó÷åííûõ â ýòîì îòíîøåíèè âèäîâ ÿâëÿåòñÿ ÷åëîâåê. Ëÿìáäà è êàïïà öåïè Èà ó ÷åëîâåêà êîäèðóþòñÿ ãåíàìè, ðàñïîëîæåíûìè â ðàçíûõ ëîêóñàõ è íà ðàçíûõ õðîìîñîìàõ. Êàïïà ëîêóñ ñîñòîèò èç áîëüøîãî êîëè÷åñòâà V_k ãåííûõ ñåãìåíòîâ, ñîáðàíûõ â ãðóïïû, ïÿòè J_k è îäíîãî Ñ_k ñåãìåíòà.. Òàêîé òèï îðãàíèçàöèè íàçûâàåòñÿ ñåãìåíòàðíûì (ðèñ. 2). Ëÿìáäà ëîêóñ ñîñòîèò èç ãðóïïû V_l ñåãìåíòîâ, òî÷íîå êîëè÷åñòâî êîòîðûõ íåèçâåñòíî, è ñåìè ïàð J_l-C_l ñåãìåíòîâ. Òðè èç íèõ (JC_l4 - JC_l6) ÿâëÿþòñÿ ïñåâäîãåíàìè (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).

 ïðîöåññå ðàçâèòèÿ Â-ëèìôîöèòà â êðîâåòâîðíûõ îðãàíàõ îäèí èç V ñåãìåíòîâ ñîåäèíÿåòñÿ ñ îäíèì èç J ñåãìåíòîâ ïîñðåäñòâîì ñàéòñïåöèôè÷åñêîé ðåêîìáèíàöèè (Schatz et al., 1992).  ýòîò ïðîöåññ âîâëåêàþòñÿ ñïåöèàëüíûå îëèãîìåðíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè: ãåïòà- è íîíàìåðû, ôëàíêèðóþùèå ñ 3' ñòîðîíû V ñåãìåíò è ñ 5' ñòîðîíû J ñåãìåíò (ðèñ. 3) (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989). Îòëè÷èòåëüíîé îñîáåííîñòüþ ëÿìáäà è êàïïà ëîêóñîâ ÿâëÿåòñÿ êîíôèãóðàöèÿ ïðîìåæóòêîâ ìåæäó ãåïòà- è íîíàìåðàìè, íàçûâàåìûõ ñïåéñåðàìè. Ñ V è J ãåííûìè ñåãìåíòàìè ëÿìáäà òèïà àññîöèèðîâàíû 23 ïí è 12 ïí ñïåéñåðû ñîîòâåòñòâåííî, à ñ V è J ñåãìåíòàìè êàïïà òèïà - 12 ïí è 23 ïí ñïåéñåðû (Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985).

ë

Ðèñ. 2. Ñõåìà ñòðîåíèÿ ëÿìáäà è êàïïà ëîêóñîâ ãåíîâ L-öåïåé Èà ÷åëîâåêà.

Ëÿìáäà ëîêóñ ñîäåðæèò ìíîãî V_l ñåãìåíòîâ è ñåìü ïàð áëèçêîðàñïîëîæåííûõ J_l-C_l. Òðè èç íèõ ÿëÿþñÿ ïñåâäîãåíàìè (Y). Êàïïà ëîêóñ ñîäåðæèò ìíîãî V_k ïÿòü J_k è îäèí C_k ãåííûé ñåãìåíò (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).