CBRR2757 (677123), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

10 ìÌ NaCl.

Çàòåì îáðàáàòûâàëè ïðîáó ÐÍÊàçîé, ñâîáîäíîé îò ÄÍÊàçû,ïðè 37^îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà â êîíöåíòðàöèè 100 ìêã/ìë. Ïîñëå ýòîãî ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) äâà ðàçà è ïðîâîäèëè äèàëèç ïðè 10^îÑ â òå÷åíèå 36 ÷àñîâ ïðîòèâ 10 ë áóôåðà TE (10 ìÌ òðèñ-HCl, 1 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ, ðÍ 7,5), ìåíÿÿ áóôåð ÷åðåç êàæäûå 12 ÷àñîâ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

ÊÎÍÑÒÐÓÈÐÎÂÀÍÈÅ ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ

Âûäåëåíèå ïîëè(A)⁺ÐÍÊ.

Äëÿ èíãèáèðîâàíèÿ ÐÍÊàçû âñå ðàñòâîðû, íå ñîäåðæàùèå òðèñ, îáðàáàòûâàëè 0,1% äèýòèëïèðîêàðáîíàòîì 12 ÷àñîâ ïðè 37^îÑ è àâòîêëàâèðîâàëè. Ïîñóäó ïðîêàëèâàëè ïðè 250^îÑ â òå÷åíèå 4 ÷àñîâ. Ïîëè(A)⁺ÐÍÊ âûäåëÿëè èç ñóììàðíîé ÐÍÊ ëåéêîöèòîâ ñòåðëÿäè ìåòîäîì õðîìàòîãðàôèè íà îëèãî(dT)-öåëëþëîçå. Äëÿ ýòîãî ÐÍÊ ðàñòâîðÿëè â âîäå, ïðîãðåâàëè ïðè 65^îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, äîáàâëÿëè ðàâíûé îáúåì 2-êðàòíîãî áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ ÐÍÊ (40 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,6, 1 Ì NaCl, 2 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ, 0,2% SDS) è òðèæäû ïðîïóñêàëè ÷åðåç êîëîíêó ñ îëèãî(dT)-öåëëþëîçîé. Çàòåì ïðîìûâàëè êîëîíêó 5-10 îáúåìàìè áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ è 4 îáúåìàìè ýòîãî æå áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 0,1 Ì NaCl. Ïîñëå ýòîãî ýëþèðîâàëè ïîëè(A)⁺ÐÍÊ â 2-3 îáúåìàõ âîäû, îáðàáîòàííîé äèýòèëïèðîêàðáîíàòîì, äîáàâëÿëè 2,2 îáúåìà ýòàíîëà è îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 12000 g ïðè 4^îÑ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

Ñèíòåç êÄÍÊ.

Ñèíòåç êÄÍÊ ïðîâîäèëè â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðîòîêîëîì ôèðìû Stratagene. Ïî ìàòðèöå ïîëè(A)⁺ÐÍÊ ñèíòåçèðîâàëè ïåðâóþ öåïü êÄÍÊ (ðèñ. 9).

Ðåàêöèîííàÿ èìåëà ñîñòàâ:

5 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà äëÿ ñèíòåçà ïåðâîé öåïè,

3 ìêë ñìåñè ìåòèë-dÍTÔ,

2 ìêë ðàñòâîðà ïðàéìåð-ëèíêåðà (1.4 ìêã/ìêë),

1 ìêë èíãèáèòîðà ÐÍÊàçíîé àêòèâíîñòè,

1.5 ìêë ôåðìåíòà îáðàòíàÿ òðàíñêðèïòàçà (50 å.à./ìêë),

âîäà äî ñóììàðíîãî îáúåìà 50 ìêë.

Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37^îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà. Çàòåì îõëàæäàëè äî 0^îÑ è äîáëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñèíòåçà âòîðîé öåïè êÄÍÊ:

20 ìêë áóôåðà äëÿ ñèíòåçà âòîðîé öåïè,

6 ìêë ñìåñè dÍTÔ,

88,9 ìêë ñòåðèëüíîé âîäû,

2 ìêë ³²Ð-dÍTÔ (800 Êè/ìÌ),

2 ìêë ðàñòâîðà ÐÍÊàçûH (1.5 å.à./ìêë),

11.1 ìêë ÄÍÊ ïîëèìåðàçû I.

Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 16^îÑ â òå÷åíèå 2,5 ÷àñîâ, çàòåì îõëàæäàëè äî 0^îÑ è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ çàñòðîéêè “ëèïêèõ” êîíöîâ:

23 ìêë ñìåñè äÍTÔ,

2 ìêë Pfu ÄÍÊ ïîëèìåðàçû (2,5 å.à./ìêë).

Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 72^îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí.

Çàòåì ïðîâîäèëè ýêñòðàêöèþ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) è ðàâíûì îáúåìîì õëîðîôîðìà, ïîñëå ÷åãî îòáèðàëè âîäíóþ ôàçó, äîáàâëÿëè 20 ìêë 3Ì NaAc è 400 ìêë 96% ýòàíîëà è îñàæäàëè êÄÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 12000 g â òå÷åíèå 12 ìèí.

Ñøèâêà ìîëåêóë êÄÍÊ ñ âåêòîðîì.

êÄÍÊ ðàñòâîðÿëè ñ EcoR I àäàïòîðàìè (ðèñ. 9) è èíêóáèðîâàëè ïðè 4^îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñøèâêè ìîëåêóë àäàïòîðîâ è ìîëåóë êÄÍÊ:

ïðàéìåð-ëèíêåð

5' CTCGAGTTTTTTTTTTTT 3'

3' AAAAAAAAAAAA 5'

ïîëè(A)⁺ÐÍÊ

Xho I ñàéò 1-ÿ öåïü EcoR I àäàïòîð

5' ð-TCGAGTTTTTTTTTTTT,,,,,,,,CTCGTGCCG-ð 3'

3' ð-CAAAAAAAAAAAA GAGCACGGCTTAA-ð 5'

2-ÿ öåïü

Xho I ñàéò êÄÍÊ EcoR I ñàéò

5' CTCGAGTTTTTTT,,,,,,,,,CTCGTGCCGAATTC 3’

3' GAGCTCAAAAAAA GAGCACGGCTTAAG 5’

ÄÍÊ âåêòîðà ÄÍÊ âåêòîðà

Ðèñ. 9. Ñõåìà ñèíòåçà êÄÍÊ ïî ìàòðèöå ïîëè(A)⁺ÐÍÊ è ñøèâêè ñ ïëàçìèäíûì âåêòîðîì

pBluescript KS(+) ïî ñàéòàì EcoR I è Xho I.

Îáîçíà÷åíèÿ:,,,,, - ìåòèëèðîâàííàÿ öåïü êÄÍÊ, -íåìåòèëèðîâàííàÿ öåïü êÄÍÊ.

1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà ëèãèðîâàíèÿ,

1 ìêë 10 ìÌ ðATÔ,

1 ìêë ôåðìåíòà ÄÍÊ ëèãàçû ôàãà Ò4 (4 å.à./ìêë).

Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 4^îÑ â òå÷åíèå 2-õ ñóòîê, ïîñëå ÷åãî èíàêòèâèðîâàëè ëèãàçó ïðîãðåâàíèåì ïðè 70^îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí, îõëàæäàëè äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ôîñôîðèëèðîâàíèÿ êîíöåâûõ íóêëåîòèäîâ:

1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà ëèãèðîâàíèÿ,

2 ìêë 10 ìÌ ðATÔ,

6 ìêë ñòåðèëüíîé âîäû,

1 ìêë ôåðìåíòà ïîëèíóêëåîòèäíîé êèíàçû ôàãà Ò4 (10 å.à./ìêë).

Ðåàêöèîííóþ ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37^îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì îõëàæäàëè äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ îáðàçîâàíèÿ ëèïêèõ êîíöîâ ïî ñàéòó ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçû Xho I:

28 ìêë áóôåðà 4,

3 ìêë Xho I (40 å.à./ìêë).

Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 37^îÑ â òå÷åíèå 1,5 ÷àñà. Çàòåì äîáàâëÿëè 5 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà STE (1 Ì NaCl, 200 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 100 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ) è ïðîïóñêàëè ÷åðåç êîëîíêó ñ ãåëåì ñåôàêðèë Ñ-500. Ôðàêöèè, ñîäåðæàùèå ìîëåêóëû ñ ðàçìåðîì áîëåå 500 ïí îáúåäèíÿëè è ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ñìåñè ôåíîë-õëîðîôîðì (1:1) è ðàâíûì îáúåìîì õëîðîôîðìà. Çàòåì äîáàâëÿëè äâîéíîé îáúåì ýòàíîëà, îñàæäàëè êÄÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ïðîìûâàëè 80% ýòàíîëîì è ðàñòâîðÿëè â 10 ìêë âîäû. Äëÿ ëèãèðîâàíèÿ áðàëè 5 ìêë ðàñòâîðà êÄÍÊ (600 íã) è 2 ìêë ðàñòâîðà âåêòîðà pBluescript KS(+) (1 ìêã), èìåþùåãî "ëèïêèå" äåôîñôîðèëèðîâàííûå êîíöû ïî ñàéòàì ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçàìè EcoR I è Xho I (ðèñ. 9).

Çàòåì äîáàâëÿëè 1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà 3, 1 ìêë 10 ìÌ ðàñòâîðà ðATÔ è 1 ìêë ôåðìåíòà ëèãàçû ôàãà Ò4 (4 å.à./ìêë). Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 4^îÑ â òå÷åíèå 2-õ ñóòîê, ïîñëå ÷åãî ýêñòðàãèðîâàëè ðàâíûìè îáüåìàìè ôåíîë-õëîðîôîðìà è õëîðîôîðìà.

Àìïëèôèêàöèÿ áèáëèîòåêè.

Ýëåêòðîòðàíñôîðìàöèþ ïðîâîäèëè êàê îïèñàíî â ï. Òðàíñôîðìàöèÿ ïðîêàðèîòè÷åñêèõ êëåòîê, ïîñëå ÷åãî âûñåâàëè 1/1000 îáúåìà (2,5 ìêë) ñðåäû SOC íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîëè÷åñòâà òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê. Îñòàëüíóþ ÷àñòü ïîìåùàëè â 100 ìë ñðåäû LB ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè ïðè 37^îÑ ïðè ïåðåìåøèâàíèè äî òåõ ïîð, ïîêà îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü íå äîñòèãíåò âåëè÷èíû D₅₅₀=2-2,5. Çàòåì îòáèðàëè 1,6õ10¹¹ êëåòîê, îñàæäàëè èõ öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ñóñïåíäèðîâàëè â 4 ìë ñðåäû LB è ïåðåìåøèâàëè ñ 4 ìë ãëèöåðèíà. Ïîëó÷åííóþ áèáëèîòåêó õðàíèëè ïðè -70^îÑ.

ÏÎËÈÌÅÐÀÇÍÀß ÖÅÏÍÀß ÐÅÀÊÖÈß

Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè (ÏÖÐ) ñîäåðæàëà ñëåäóþùèå êîìïîíåíòû:

100 íã ÄÍÊ ìàòðèöû,

100 íã íåâûðîæäåííîãî ïðàéìåðà,

500 íã âûðîæäåííîãî ïðàéìåðà,

5 ìêë 2 ìÌ ðàñòâîðà äÍTÔ,

5 ìêë 1-êðàòíîãî áóôåðà (10 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,8, 50 ìÌ KCl, 1,5 ìÌ MgCl₂, 0,001% æåëàòèí),

1 ìêë Taq ïîëèìåðàçû,

âîäà äî êîíå÷íîãî îáúåìà 50 ìêë (Dieffenbach and Dveksler, 1995).

Òåìïåðàòóðíûé ðåæèì ÏÖÐ.

Ðåàêöèîííóþ ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè 95^îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè Taq ïîëèìåðàçó è èñïîëüçîâàëè òåìïåðàòóðíûé ðåæèì, ïðè êîòîðîì â òå÷åíèå ïåðâûõ 18 öèêëîâ òåìïåðàòóðó îòæèãà ïðàéìåðîâ ïîíèæàëè íà 3^îÑ ÷åðåõ êàæäûå òðè öèêëà:

1^é-18^é öèêëû 95^îÑ - 1 ìèí (äåíàòóðàöèÿ ÄÍÊ),

50-35^îÑ - 1 ìèí (îòæèã ïðàéìåðîâ),

72^îÑ - 2 ìèí (ïîëèìåðèçàöèÿ).

19^-é-30^-é öèêëû: 95^îÑ - 1 ìèí,

50^îÑ - 1 ìèí,

72^îÑ - 2 ìèí.

31^-é öèêë: 95^îÑ - 1 ìèí,

50^îÑ - 1 ìèí,

72^îÑ - 10 ìèí.

ÑÓÁÊËÎÍÈÐÎÂÀÍÈÅ ÄÍÊ

Ôðàãìåíòû ÄÍÊ, ïîëó÷åííûå â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ, ðàçäåëÿëè â 1% àãàðîçíîì ãåëå è âûäåëÿëè êàê îïèñàíî â ï. Âûäåëåíèå ÄÍÊ èç ãåëÿ. Çàòåì îñàæäàëè ÄÍÊ ýòàíîëîì, ðàñòâîðÿëè â 5-10 ìêë âîäû è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ óäàëåíèÿ âûñòóïàþùèõ íóêëåîòèäîâ ñ 3' êîíöà ÄÍÊ:

1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (200 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,2, 100 ìÌ KÑl, 60 ìÌ (NH₄)₂SO₄, 20 ìÌ MgCl₂, 1% òðèòîí Õ-100 è 100 ìêã/ìë áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí),

1 ìêë 10 ìÌ dÍTÔ,

1 ìêë Pfu ÄÍÊ ïîëèìåðàçû (2,5 å.à./ìêë),

âîäó äî êîíå÷íîãî îáúåìà 10 ìêë.

Ñìåñü èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè 72^îÑ ïîñëå ÷åãî îõëàæäàëè äî 0^îÑ è äîáàâëÿëè êîìïîíåíòû äëÿ ñøèâêè ñ âåêòîðîì pBluescript KS(+) ïî ñàéòó ðåñòðèêöèè Sma I:

1 ìêë ðàñùåïëåííîãî âåêòîðà (0,5 ìêã),

1 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (50 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 7 ìÌ MgCl₂, 1 ìÌ ÄÒÒ),

1 ìêë 10 ìÌ äATÔ,

1 ìêë ÄÍÊ ëèãàçû ôàãà Ò4 è âîäó äî êîíå÷íîãî îáúåìà 10 ìêë.

Ñìåñü èíêóáèðîâàëè îäíè ñóòêè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è çàòåì èñïîëüçîâàëè äëÿ õèìè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè êëåòîê E.coli. Òðàíñôîðìèðîâàííûå êëåòêè âûñåâàëè íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó: 1,5% LB-àãàð ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë), òåòðàöèêëèíîì (15 ìêã/ìë), ÈÏÒà (2 ìÌ), X-Gal (500 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè 14 ÷àñîâ ïðè 37^îÑ. Ïîñëå ýòîãî îòáèðàëè êîëîíèè áåëîãî öâåòà (Ìàíèàòèñ è äð., 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).

ÑÊÐÈÍÈÍà ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ

Áèáëèîòåêó êÄÍÊ âûñåâàëè íà ÷àøêè Ïåòðè ñ 1,5% LB-àãàðîì ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë) èç ðàñ÷åòà 4000 êîëîíèé íà ÷àøêó è èíêóáèðîâàëè ïðè 37^îÑ äî òåõ ïîð ïîêà êîëîíèè íå äîñòèãíóò 0,5-1 ìì â äèàìåòðå. Êîëîíèè ïåðåíîñèëè íà íåéëîíîâóþ ìåìáðàíó è èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â äåíàòóðèðóþùåì ðàñòâîðå (0,5 Ì NaOH, 1,5 Ì NaCl) â òå÷åíèå 7 ìèí è äâà ðàçà ïî 2 ìèí â íåéòðàëèçóþùåì ðàñòâîðå (1,5 Ì NaCl, 0,5 Ì òðèñ-HCl, ðÍ 7,5). Çàòåì ñïîëàñêèâàëè ìåìáðàíó â 2-êðàòíîì áóôåðå SSC (0,3 Ì NaCl, 0,03 Ì öèòðàò íàòðèÿ), âûñóøèâàëè è ôèêñèðîâàëè ÄÍÊ â òå÷åíèå 10 ìèí óëüòðàôèîëåòîâûì èçëó÷åíèåì ñ äëèíîé âîëíû 310 íì. Ïîñëå ýòîãî ìåìáðàíó ïîìåùàëè â 50 ìë ïðåäãèáðèäèçàöèîííîãî ðàñòâîðà (ðàñòâîð 1), ñîäåðæàùåãî:

6-êðàòíûé SSC (0.9 Ì NaCl, 0,09 Ì öèòðàò íàòðèÿ),

5-êðàòíûé ðàñòâîð Äåíõàðäòà (0,1% áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí, 0,1% ôèêîë, 0,1% ïîëèâèíèëïèðîëèäîí),

0,5% SDS,

10% äåêñòðàí ñóëüôàò,

500 ìêã äåíàòóðèðèðîâàííîé ÄÍÊ öûïëåíêà,

è èíêóáèðîâàëè 1 ÷àñ ïðè 55^îÑ. Ïîñëå ýòîãî äîáàâëÿëè ìå÷åíóþ ³²P-äATÔ ÄÍÊ çîíäà è èíêóáèðîâàëè 12-18 ÷àñîâ ïðè 55^îÑ ïðè ïîñòîÿííîì ïîêà÷èâàíèè.

Ïîñëå ãèáðèäèçàöèè ïðîâîäèëè ïðîìûâàíèå ìåìáðàíû äâà ðàçà ïî 10 ìèí â 200 ìë 2-êðàòíîãî SSC + 0,1% SDS ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, 15 ìèí â 1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS% ïðè 55^îÑ è äâà ðàçà ïî 10 ìèí â 0,1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS ïðè 55^îÑ. Ýêñïîíèðîâàíèå ïðîâîäèëîñü â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ ïðè -70^îÑ ñ ðåíòãåíîâñêîé ïëåíêîé (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÍÓÊËÅÎÒÈÄÍÎÉ ÏÎÑËÅÄÎÂÀÒÅËÜÍÎÑÒÈ ÄÍÊ

Íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÄÍÊ îïðåäåëÿëè ïî ìåòîäó Ñýíãåðà (Sanger et al., 1977). 5 ìêã ïëàçìèäíîé ÄÍÊ, î÷èùåíîé ãåëü-ôèëüòðàöèåé íà êîëîíêå ñ áèîãåëåì Ï-10, äåíàòóðèðîâàëè â 50 ìêë 0.2 Ì NaOH ïðè 37^îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí, çàòåì äîáàâëÿëè 5 ìêë 3 Ì NaAc, ðÍ 5,1, äâîéíîé îáúåì ýòàíîëà è èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè òåìïåðàòóðå -70^îÑ. Ïîñëå ýòîãî îñàæäàëè ÄÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 12000 g â òå÷åíèå 12 ìèí è ïðîìûâàëè îñàäîê 100 ìêë 80% ýòàíîëà. Îñàäîê ÄÍÊ âûñóøèâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è ðàñòâîðÿëè â 7,5 ìêë âîäû, äîáàâëÿëè 2 ìêë 5-êðàòíîãî áóôåðà (200 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 100 ìÌ MgCl₂, 250 ìÌ NaCl), 0,5 ìêë ïðàéìåðà (50 íã) è èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè 37^îÑ. Ïîñëå ýòîãî ïðîáèðêó ïîìåùàëè â ëåä è äîáàâëÿëè 1 ìêë 0,1 Ì ÄÒÒ, 2 ìêë 1,5 ìêÌ äÍTÔ áåç äATÔ, 0,5 ìêë ðàñòâîðà ³⁵S-äATÔ è 2 ìêë ÄÍÊ ïîëèìåðàçû ôàãà Ò7 (2,5 å.à./ìêë). Çàòåì èíêóáèðîâàëè 3 ìèí ïðè 20^îÑ è ñðàçó îòáèðàëè ïî 3,5 ìêë â ÷åòûðå ïðîáèðêè, êàæäàÿ èç êîòîðûõ ñîäåðæàëà ïî 2,5 ìêë 80 ìêÌ ñìåñè ÷åòûðåõ äÍTÔ, 50 ìÌ NaCl è 8 ìêÌ îäíîãî èç ääÍTÔ. Èíêóáèðîâàëè 5 ìèí ïðè 37^îÑ è äîáàâëÿëè ïî 4 ìêë ñòîï-ðàñòâîðà (95% ôîðìàìèä, 20 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ, 0,05% áðîìôåíîëîâûé ñèíèé, 0,05% êñèëåí öèàíîë). Ïîëó÷åííûå îáðàçöû èíêóáèðîâàëè 3 ìèí ïðè 100^îÑ, áûñòðî îõëàæäàëè äî 0^îÑ è îòáèðàëè ïî 2 ìêë äëÿ ýëåêòðîôîðåçà â äåíàòóðèðóþùåì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå, èìåþùåì ñîñòàâ:

6% àêðèëàìèä,

8 Ì ìî÷åâèíà,

Характеристики

Список файлов реферата