CBRR2757 (677123), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Ðèñ. 8. Ýâîëþöèîííîå äðåâî íèçøèõ ïîçâîíî÷íûõ ( ïî Ñåâåðöåâó À. Í., 1939).

Îáîçíà÷åíèÿ: - òàêñîíû, èìåþùèå íûíå æèâóùèõ ïðåäñòàâèòåëåé, - òàêñîíû, ñóùåñòâîâàíèå êîòîðûõ äîêàçàíî ïàëåîíòîëîãè÷åñêèìè èññëåäîâàíèÿìè.

ÌÀÒÅÐÈÀËÛ È ÌÅÒÎÄÛ

ÝËÅÊÒÐÎÔÎÐÅÇ ÄÍÊ

 àãàðîçíîì ãåëå.

Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ ïðîâîäèëè â 1% àãàðîçíîì ãåëå â 1-êðàòíîì áóôåðå ÒÀÅ, èìåþùåì ñîñòàâ: 0.04 Ì òðèñ-àöåòàò, 2 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

 ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå.

Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ ïðîâîäèëè â 6% ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå â 0,5-êðàòíîì áóôåðå ÒÁÅ, èìåþùåì ñîñòàâ: 0,089 Ì òðèñ-áîðàò, 0,089 Ì áîðíàÿ êèñëîòà, 2 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ. Äëÿ ïîëèìåðèçàöèè ãåëÿ ê 50 ìë ðàñòâîðà äîáàâëÿëè 300 ìêë 10% ðàñòâîðà ïåðñóëüôàòà àììîíèÿ è 30 ìêë ÒÅÌÅÄ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÄÍÊ ÈÇ ÃÅËß

Àäñîðáöèÿ íà äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçå.

Ãåëü îêðàøèâàëè â ðàñòâîðå áðîìèñòîãî ýòèäèÿ, ó÷àñòîê ãåëÿ ñ ïîëîñîé ÄÍÊ âûðåçàëè, ïîìåùàëè â êàìåðó è ïåðåíîñèëè ÄÍÊ íà äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçó â 0,5-êðàòíîì áóôåðå ÒÁÅ (ñì. Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ (2)) ïðè íàïðÿæåíèè 40 Â/ñì. Ýëþöèþ ÄÍÊ ñ äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçû ïðîâîäèëè ïóòåì èíêóáèðîâàíèÿ â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè 70^îÑ â áóôåðå, èìåþùåì ñîñòàâ: 2 ìÌ NaCl, 1 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ, 40 ìÌ òðèñ ðÍ 8,0 (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

Àäñîðáöèÿ íà êðåìíèåâîé ïóäðå.

Àãàðîçíûé ãåëü îêðàøèâàëè â ðàñòâîðå áðîìèñòîãî çòèäèÿ, âûðåçàëè ó÷àñòîê ãåëÿ ñ ÄÍÊ è ðàñïëàâëÿëè èíêóáèðîâàíèåì ñ äâîéíûì îáúåìîì 6 Ì ðàñòâîðà KI â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 55^îÑ. Çàòåì äîáàâëÿëè ñóñïåíçèþ êðåìíèåâîé ïóäðû (ñèëèêè) â 3 Ì ðàñòâîðå KI â êîíöåíòðàöèè 100 ìã/ìë èç ðàñ÷åòà 300 ìêã ñèëèêè íà 1 ìêã ÄÍÊ è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 2 ìèí ïðè 55^îÑ. Ïîñëå ýòîãî îñàæäàëè ñèëèêó öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 2000 g â òå÷åíèå 2 ìèí è äâàæäû ïðîìûâàëè ñóñïåíäèðîâàíèåì â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì 50 ìÌ NaCl, 10 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,0, 2,5 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ è 50% ýòèëîâûé ñïèðò. Ýëþèðîâàëè ÄÍÊ ñ ñèëèêè ñóñïåíäèðîâàíèåì â âîäå (Boyle, Lew, 1995).

Çàìîðàæèâàíèå - îòòàèâàíèå.

Àãàðîçíûé ãåëü ñ ÄÍÊ 10 ìèí èíêóáèðîâàëè â æèäêîì àçîòå è îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 12000 g â òå÷åíèå 15 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè ê ñóïåðíàòàíòó 1/10 îáúåìà 3 Ì NaAc, 2 îáúåìà ýòàíîëà è îñàæäàëè ÄÍÊ ïðè 12000 g â òå÷åíèå 10 ìèí.

ÏÎËÓ×ÅÍÈÅ ÐÀÄÈÎÀÊÒÈÂÍÛÕ ÇÎÍÄÎÂ

500 íã ÄÍÊ-ìàòðèöû è 100 íã ïðàéìåðà äåíàòóðèðîâàëè â 10 ìêë âîäû ïðè 100^îÑ â òå÷åíèå 10 ìèí è áûñòðî îõëàæäàëè äî 0^îÑ. Çàòåì äîáàâëÿëè 10 ìêë 10-êðàòíîãî áóôåðà (40 ìÌ KP0₄ ðÍ 7,5, 6,6 ìÌ MgCl₂ è 1,0 ìÌ 2-ìåðêàïòîýòàíîë), 0,1-0,5 ìÊè ³²Ð-dATÔ, 10 ìêë 2 ìÌ ðàñòâîðà òðåõ äðóãèõ íåìå÷åíûõ äÍTÔ äî êîíöåíòðàöèè 200 ìêÌ. Îáúåì ðåàêöèîííîé ñìåñè äîâîäèëè âîäîé äî 100 ìêë, äîáàâëÿëè 3 ìêë ôðàãìåíòà Êëåíîâà ÄÍÊ-ïîëèìåðàçû I (10-12 å.à.) è èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 30 ìèí. Î÷èñòêó çîíäà ïðîâîäèëè ìåòîäîì ãåëü - ôèëüòðàöèè íà êîëîíêå ñ áèîãåëåì Ï-10 (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ ÄÍÊ

Êëåòêè Escherichia coli, âûðàùåííûå â ñðåäå Ëóðèà-Áåðòàíè (1% NaCl, 1% áàêòî-òðèïòîí, 0,5% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, ðÍ 7,5) (ñðåäà LB) ñ àìïèöèëëèíîì (50 ìêã/ìë), îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g. Çàòåì îñàäîê ñóñïåíäèðîâàëè â áóôåðå STET (8% ñàõàðîçà, 0,5% òðèòîí X-100, 10 ìÌ òðèñ-HCl è 50 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ, ðÍ 8,0) è äîáàâëÿëè ëèçîöèì äî êîíöåíòðàöèè 0,8 ã/ìë. Ñìåñü èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 5 ìèí è ïðè 100^îÑ â òå÷åíèå 1 ìèí. Ïîñëå ýòîãî êëåòî÷íûé äåáðèñ îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 16000 g â òå÷åíèå 15 ìèí.

Äëÿ îñàæäåíèÿ ïëàçìèäíîé ÄÍÊ ê ñóïåðíàòàíòó äîáàâëÿëè 1/10 îáúåìà 3 Ì ðàñòâîðà àöåòàòà íàòðèÿ, ðàâíûé îáúåì èçîïðîïàíîëà è öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 16000 g â òå÷åíèå 15 ìèí ïðè 20^îÑ. Çàòåì ïðîìûâàëè îñàäîê äîáàâëåíèåì 80% ýòàíîëà è ïîâòîðíûì öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òå÷åíèå 5 ìèí ïðè 20^îÑ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

Î×ÈÑÒÊÀ ÏËÀÇÌÈÄÍÎÉ ÄÍÊ ÌÅÒÎÄÎÌ ÐÀÂÍÎÂÅÑÍÎÃÎ ÖÅÍÒÐÈÔÓÃÈÐÎÂÀÍÈß Â ÃÐÀÄÈÅÍÒÅ ÏËÎÒÍÎÑÒÈ CsCl

Íà êàæäûå 10 ìë ðàñòâîðà ïëàçìèäíîé ÄÍÊ, ïîëó÷åííîãî ïîñëå îñàæäåíèÿ ëèçèðîâàííûõ êëåòîê (ñì. Âûäåëåíèå ïëàçìèäíîé ÄÍÊ), äîáàâëÿëè 1 ã ñóõîãî CsCl, ñîëü ðàñòâîðÿëè, ïîñëå ÷åãî íà êàæäûå 10 ìë ðàñòâîðà äîáàâëÿëè 0,8 ìë ðàñòâîðà áðîìèñòîãî ýòèäèÿ ñ êîíöåíòðàöèåé 10 ìã/ìë. Ñìåñü ïîìåùàëè â öåíòðèôóæíûå ïðîáèðêè Beckman, çàïîëíÿëè äîâåðõó ðàñòâîðîì CsCl è áðîìèñòîãî ýòèäèÿ òîé æå ïëîòíîñòè è öåíòðèôóãèðîâàëè â ðîòîðå Ti 60 ïðè 45000 îá/ìèí è òåìïåðàòóðå 20^îÑ â òå÷åíèå 36 ÷àñîâ. Ïîñëå ýòîãî îòáèðàëè êîëüöåâóþ êîâàëåíòíî çàìêíóòóþ ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ è ýêñòðàãèðîâàëè áðîìèñòûé ýòèäèé èç ðàñòâîðà äî ïîëíîãî îáåñöâå÷èâàíèÿ ðàâíûì îáúåìîì í-áóòàíîëà, ïðåäâàðèòåëüíî íàñûùåííîãî 1 Ì ðàñòâîðîì NaCl.

ÄÍÊ îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 15000 g, äîáàâèâ ðàâíûé îáúåì 1 Ì ðàñòâîðà NH₄Cl è äâà îáúåìà ýòàíîëà. Ïîñëå ïðîìûâàíèÿ ýòàíîëîì îñàäîê ÄÍÊ ðàñòâîðÿëè â âîäå äî êîíöåíòðàöèè 1 ìêã/ìêë (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÀÖÈß ÏÐÎÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÊËÅÒÎÊ

Õèìè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ.

Äëÿ ïîäãîòîâêè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê E.coli øòàìì XL-1 Blue MRF ' è âûðàùèâàëè â 100 ìë 2-êðàòíîé ñðåäû Ëóðèà (2% áàêòî-òðèïòîí, 1% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 0,1% NaCl, 0,4% ãëþêîçà, ðÍ 7,0) ïðè 37^îÑ äî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè D₅₅₀=0,35. Êëåòî÷íóþ ñóñïåíçèþ âûäåðæèâàëè ïðè 0^îÑ â òå÷åíèå 2 ÷àñîâ. Çàòåì êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g, òåìïåðàòóðå 4^îÑ è ñóñïåíäèðîâàëè â 50 ìë ëåäÿíîãî áóôåðà À (100 ìÌ CaCl₂, 70 ìÌ MnCl₂, 40 ìÌ NaAc, ðÍ 5,5). Ïîñëå ýòîãî ñóñïåíçèþ êëåòîê âûäåðæèâàëè ïðè 0^îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí, ïîñëå ÷åãî êëåòêè îñàæäàëè è ñóñïåíäèðîâàëè â 5 ìë áóôåðà À ñ 15% ãëèöåðèíà.

Äëÿ òðàíñôîðìàöèè ê 200 ìêë ñóñïåíçèè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê äîáàâëÿëè 30 íã ïëàçìèäíîé ÄÍÊ, ðàñòâîðåííîé â 100 ìêë âîäû è âûäåðæèâàëè ïðè 0^îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì èíêóáèðîâàëè ïðè 37^îÑ â òå÷åíèå 5 ìèí, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè 3 ìë ñðåäû LB è èíêóáèðîâàëè ïðè 37^îÑ åùå 90 ìèí. Êëåòêè ñîáèðàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì è âûñåâàëè íà ñåëåêòèâíóþ ñðåäó (Ìàçèí è äð., 1988).

Ýëåêòðîòðàíñôîðìàöèÿ.

Äëÿ ïîäãîòîâêè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê E.coli øòàìì XL-1 Blue MRF ' âûðàùèâàëè â 100 ìë ñðåäû LB (ñì. Õèìè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ) ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå äî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè D₅₅₀=0,45. Çàòåì êëåòêè îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g, 4^îÑ è ïðîìûâàëè ñóñïåíäèðîâàíèåì ïîñëåäîâàòåëüíî â 100 ìë, 50 ìë è 10ìë 10% ðàñòâîðà ãëèöåðèíà ïðè 0-4^îÑ. Ïîñëå ýòîãî êëåòêè ñóñïåíäèðîâàëè â 240 ìêë ëåäÿíîãî ðàñòâîðà GYT (10% ãëèöåðèí, 0,125% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 0,25% áàêòî-òðèïòîí).

Äëÿ òðàíñôîðìàöèè ê 40 ìêë ñóñïåíçèè êîìïåòåíòíûõ êëåòîê äîáàâëÿëè 1 ìêë ÄÍÊ âåêòîðà (50 íã) ïðè 0-4^îÑ è ïðîïóñêàëè ýëåêòðè÷åñêèé ðàçðÿä (U=18000 Â). Çàòåì äîáàâëÿëè 1 ìë SOC (2% áàêòî-òðèïòîí, 0,5% áàêòî-äðîææåâîé ýêñòðàêò, 10 ìÌ NaCl, 2,5 ìÌ KCl, 10 ìÌ MgCl₂, 10 ìÌ MgSO₄, 20 ìÌ ãëþêîçà), ïåðåìåøèâàëè, ïåðåíîñèëè â 3 ìë ñðåäû SOC, ïðîãðåòîé äî 42^îÑ, è èíêóáèðîâàëè ïðè 37^îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà (Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995).

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ ÈÇ ÊÐÎÂÈ ÐÛÁ

Êðîâü ñîáèðàëè íà õîëîäó ÷åðåç êàóäàëüíóþ àðòåðèþ ñ äîáàâëåíèåì íà êàæäûå 5 ìë êðîâè 1 ìë 2,7% ðàñòâîðà Na₂ÝÄÒÀ, ðÍ 7,4. Ê âûäåëåííîé êðîâè äîáàâëÿëè ðàâíûé îáúåì òðèñ-ñîëåâîãî áóôåðà (TBS) (0,14 Ì NaCl, 5 ìÌ KCl, 25 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,4). Ñìåñü íàíîñèëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå íà ðàâíûé îáúåì ñðåäû äëÿ âûäåëåíèÿ ëåéêîöèòîâ, ñîäåðæàùåé 24 ÷àñòè 9% ôèêîëà è 10 ÷àñòåé 34% âåðîãðàôèíà. Ïîñëå öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ïðè 400 g â òå÷åíèå 30 ìèí îòáèðàëè ñëîé ëåéêîöèòîâ è ðàçâîäèëè â áîëüøîì îáúåìå áóôåðà TBS. Ïîñëå ïîâòîðíîãî öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ïðè 300 g â òå÷åíèå 40 ìèí äëÿ ëèçèñà îñòàòî÷íûõ ýðèòðîöèòîâ êëåòêè ñóñïåíäèðîâàëè â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì 9 îáúåìîâ 0,83% ðàñòâîðà NH₄Cl è 1 îáúåì 2,06% ðàñòâîðà òðèñ-HCl, ðÍ 7,62, äî êîíöåíòðàöèè 10⁸ êë/ìë è äîáàâëÿëè 5 îáúåìîâ ñðåäû. Ïîñëå îñàæäåíèÿ êëåòîê ïðè 300 g â òå÷åíèå 10 ìèí ïðîöåäóðó î÷èñòêè ïîâòîðèëè (Ôðèìåëü, 1987).

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÑÓÌÌÀÐÍÎÉ ÐÍÊ ÈÇ ËÅÉÊÎÖÈÒÎÂ

Îñàäîê ëåéêîöèòîâ ïîñëå âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè ñóñïåíäèðîâàëè â 10 îáúåìàõ (1 ìë) ðàñòâîðà 1, ñîäåðæàùåãî 4 Ì ãóàíèäèí òèîöèàíàò, 25 ìÌ öèòðàò íàòðèÿ, ðÍ 7,0, 0,5% ñàðêîçèë è 0,1 Ì 2-ìåðêàïòîýòàíîë, ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Çàòåì äîáàâëÿëè 0,1 ìë 2 Ì ðàñòâîðà NaAc, ðÍ 4,0, 1 ìë ôåíîëà, 0,2 ìë õëîðîôîðìà è ïåðåìåøèâàëè. Çàòåì öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 10000 g â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 4^îÑ, îòáèðàëè âîäíóþ ôàçó, äîáàâëÿëè ê íåé ðàâíûé îáúåì èçîïðîïàíîëà è îñàæäàëè ÐÍÊ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 15000 g â òå÷åíèå 15 ìèí ïðè 4^îÑ (Chomczynski and Sacchi, 1987).

ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÂÛÑÎÊÎÌÎËÅÊÓËßÐÍÎÉ ÄÍÊ ÈÇ ÝÓÊÀÐÈÎÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÊËÅÒÎÊ

1 ã ïå÷åíè ñòåðëÿäè, çàìîðîæåííîé â æèäêîì àçîòå, ðàñòèðàëè â òîíêèé ïîðîøîê è ãîìîãåíèçèðîâàëè â 15 ìë ðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî 0,5 Ì Na₂ÝÄÒÀ, ðÍ 8,0, 0,5% ñàðêîçèëà, 100 ìêã/ìë ïðîòåèíàçû Ê è íàãðåòîãî äî 65^îÑ. Çàòåì èíêóáèðîâàëè ïðè 50^îÑ òå÷åíèå 3 ÷àñîâ ïðè ëåãêîì ïîêà÷èâàíèè. Çàòåì, èçáåãàÿ ðåçêèõ âñòðÿõèâàíèé, ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ðàâíûì îáúåìîì ôåíîëà òðè ðàçà, êàæäûé ðàç ðàçäåëÿÿ ôðàêöèè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 4000 g è êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Ôåíîë ïðåäâàðèòåëüíî î÷èùàëè ïåðåãîíêîé è íàñûùàëè áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 1 Ì òðèñ-HCl, îäèí ðàç è äâà ðàçà áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 0,1 Ì òðèñ-HCl è 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîë. Äèàëèç ÄÍÊ ïðîâîäèëè ïðè 10^îÑ â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ ïðîòèâ 4 ë áóôåðà, èìåþùåãî ñîñòàâ:

50 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,0,

10 ìÌ Na₂ÝÄÒÀ,

Характеристики

Список файлов реферата