CBRR2757 (677123), страница 6
Текст из файла (страница 6)
1-êðàòíûé ãëèöåðèí-òîëåðàíòíûé áóôåð (1,1% òðèñ, 0,36% òàóðèí, 0,02% Na2ÝÄÒÀ).
Ýëåêòðîôîðåç ïðîâîäèëè ïðè íàïðÿæåíèè 40 Â/ñì. Çàòåì ãåëü âûäåðæèâàëè 30 ìèí â 10% óêñêñíîé êèñëîòå, âûñóøèâàëè è ýêñïîíèðîâàëè 12 ÷àñîâ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå ñ ðåíòãåíîâñêîé ïëåíêîé (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).
ÑÀÓÇÅÐÍ ÁËÎÒ ÃÈÁÐÈÄÈÇÀÖÈß
10 ìêã ãåíîìíîé ÄÍÊ, âûäåëåííîé èç ïå÷åíè ñòåðëÿäè, èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 2 ÷àñîâ ñ ýíäîíóêëåàçàìè ðåñòðèêöèè Pst I è Pvu II (ïî 50 å.à.) ïðè 37îÑ â áóôåðå, ñîäåðæàùåì 100 ìÌ NaCl, 10 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 10 ìÌ MgCl2, 100 ìêã/ìë áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí, 6 ìÌ 2-ìåðêàïòîýòàíîë. Çàòåì ýêñòðàãèðîâàëè ÄÍÊ ïîñëåäîâàòåëüíî ðàâíûìè îáúåìàìè ôåíîë-õëîðîôîðìà (1:1) è õëîðîôîðìà, îñàæäàëè ÄÍÊ äâóìÿ îáúåìàìè ýòàíîëà, ðàñòâîðÿëè â âîäå è íàíîñèëè íà 1% àãàðîçíûé ãåëü. Ýëåêòðîôîðåç ïðîâîäèëè ïðè íàïðÿæåíèè 1 Â/ñì è òåìïåðàòóðå 12îÑ â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ. Çàòåì ãåëü èíêóáèðîâàëè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå 30 ìèí â 0,25 Ì HCl, 30 ìèí â äåíàòóðèðóþùåì ðàñòâîðå (0,5 Ì NaOH, 1,5 M NaCl) è 10-15 ìèí â ðàñòâîðå 1 (0,25 Ì NaOH, 1,5 M NaCl). Ïîñëå ýòîãî ÄÍÊ ïåðåíîñèëè íà íåéëîíîâóþ ìåìáðàíó ìåòîäîì âàêóóìíîãî ïåðåíîñà â ðàñòâîðå 1. Ìåìáðàíó ñïîëàñêèâàëè â 2-êðàòíîì SSC, âûñóøèâàëè è ôèêñèðîâàëè ÄÍÊ â òå÷åíèå 10 ìèí óëüòðàôèîëåòîâûì èçëó÷åíèåì ñ äëèíîé âîëíû 310 íì.
Ïðåäãèáðèäèçàöèþ ïðîâîäèëè ïðè 55îÑ â òå÷åíèå 1 ÷àñà â ðàñòâîðå 1 (ñì. Ñêðèíèíã áèáëèîòåêè êÄÍÊ). Ãèáðèäèçàöèÿ äëèëàñü 12-16 ÷àñîâ ïðè 55îÑ ñ êîíöåíòðàöèåé çîíäà íå áîëåå 10 íã/ìë.
Îòìûâêó ïðîâîäèëè äâà ðàçà ïî 10 ìèí â 2-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è îäèí ðàç 15 ìèí â 1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS ïðè 55îÑ. Ýêñïîíèðîâàíèå äëèëîñü 12 ÷àñîâ ïðè -70îÑ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).
ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ
ÊÎÍÑÒÐÓÈÐÎÂÀÍÈÅ ÁÈÁËÈÎÒÅÊÈ êÄÍÊ È ÅÅ ÑÊÐÈÍÈÍÃ
 êà÷åñòâå èñòî÷íèêà ìÐÍÊ áðàëè ëåéêîöèòû ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè ñòåðëÿäè. Íà îñíîâå ýòîé ìÐÍÊ ñèíåçèðîâàëè êÄÍÊ. Ïîëó÷åííûå ìîëåêóëû êÄÍÊ êëîíèðîâàëè â ïëàçìèäíîì âåêòîðå pBluescript KS(+), ïîñëå ÷åãî òðàíñôîðìèðîâàëè ýòèì âåêòîðîì êëåòêè E.coli øòàììà XL-1 Blue MRF’.  ðåçóëüòàòå ýòîãî áûëà ïîëó÷åíà áèáëèîòåêà êÄÍÊ ïðåäñòàâèòåëüíîñòüþ 6 ìèëëèîíîâ êëîíîâ. Áèáëèîòåêó àìïëèôèöèðîâàëè äî îáúåìà 5 õ 1011 êëåòîê.
Cóììàðíóþ ïëàçìèäíóþ ÄÍÊ áèáëèîòåêè âûäåëÿëè è èñïîëüçîâàëè â ÏÖÐ ñ ïàðîé ïðàéìåðîâ, îäèí èç êîòîðûõ ãîìîëîãè÷íåí ó÷àñòêó âåêòîðà âáëèçè ñàéòà êëîíèðîâàíèÿ ìîëåêóëû êÄÍÊ è ðàñïîëàãàåòñÿ â êîäèðóþùåé îðèåíòàöèè. Âòîðîé ïðàéìåð âûðîæäåííûé, ñîîòâåòñòâóþùèé íàèáîëåå êîíñåðâàòèâíîìó ó÷àñòêó ïîñëåäîâàòåëüíîñòè J-ñåãìåíòîâ L-öåïåé Èà ïîçâîíî÷íûõ â íåêîäèðóþùåé îðèåíòàöèè (ðèñ. 10).
Îäèí èç ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ, ïîëó÷åííûõ â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ, ñîîòâåòñòâîâàë îæèäàåìîìó ðàçìåðó (370 ïí). Ýòîò ôðàãìåíò âûäåëÿëè è ñóáêëîíèðîâàëè â âåêòîðå pBluescript KS(+). Îïðåäåëåíèå íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ýòîãî ôðàãìåíòà ïîêàçàëî, ÷òî îí ãîìîëîãè÷åí ãåíàì V îáëàñòè L-öåïåé Èà (Ðèñ. 11).
Ýòîò ôðàãìåíò áûë èñïîëüçîâàí â êà÷åñòâå çîíäà äëÿ ñêðèíèíãà áèáëèîòåêè êÄÍÊ ëåéêîöèòîâ ñòåðëÿäè. Ñêðèíèíã 4000 êîëîíèé áèáëèîòåêè êÄÍÊ â ìÿãêèõ óñëîâèÿõ ãèáðèäèçàöèè ïîçâîëèë âûÿâèòü ïÿòü êëîíîâ ñ ðàçìåðîì âñòàâêè êÄÍÊ îò 800 äî 1050 ïí. Äëÿ ÷åòêîãî ðàçäåëåíèÿ êëîíîâ ïðîâîäèëè âòîðè÷íûé ñêðèíèíã áèáëèîòåêè êÄÍÊ, ïîñëå ÷åãî âûäåëåííûå êëîíû àìïëèôèöèðîâàëè.
ïðàìåð Ò3
5'-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3';
J-ïðàéìåð
5'-A(G/C)(T/C)(T/C)TGGT(T/G/C)CCTTTTCC(A/G)AA-3’
Ðèñ. 10. Ñõåìà ÏÖÐ. Ò3 ïðàéìåð ðàñïîëàãàåòñÿ âáëèçè ñàéòà êëîíèðîâàíèÿ ìîëåêóëû êÄÍÊ è êîìïëèìåíòàðåí íåêîäèðóþùåé öåïè, J-ïðàéìåð ãîìîëîãè÷åí ó÷àñòêó êîäèðóþùåé öåïè J-ñåãìåíòà ãåíîâ L-öåïåé Èà ïîçâîíî÷íûõ. Îæèäàåìàÿ äëèíà ïðîäóêòîâ îêîëî 400 ïí.
ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÏÅÐÂÈ×ÍÎÉ ÑÒÐÓÊÒÓÐÛ
Îïðåäåëåíà íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü âñòàâêè êÄÍÊ êëîíà Â1. êÄÍÊ êëîíà Â1 ðàçìåðîì 1050 ïí ïðåäñòàâëÿëà ñîáîé ïîëíîðàçìåðíóþ êîïèþ çðåëîãî ãåíà L-öåïè Èà è ñîäåðæàëà 5’-íåòðàíñëèðóåìóþ îáëàñòü, ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîäèðóþùóþ ëèäåðíûé ïåïòèä, V îáëàñòü, Ñ îáëàñòü, à òàêæå 3’-íåòðàíñëèðóåìóþ îáëàñòü (Ðèñ. 11). Íà îñíîâå ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðû êëîíà Â1 ñêîíñòðóèðîâàëè è ñèíòåçèðîâàëè òðè ïðàéìåðà, ñîîòâåòñòâóþùèõ êîíñåðâàòèâíûì ðàéîíàì V è C îáëàñòè è èñïîëüçîâàëè èõ äëÿ îïðåäåëåíèÿ íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè êëîíîâ Å4 è Ñ2. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà Å4 áûëà îïðåäåëåíà òîëüêî â îáëàñòè, ïðèìûêàþùåé ê Ò3 ïðîìîòîðó âåêòîðà. Çà èñêëþ÷åíèåì 2 íóêëåîòèäîâ îíà ïîëíîñòüþ èäåíòè÷íà ïîñëåäîâàòåëüíîñòè Â1. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà Ñ2 èìåëà õèìåðíûé õàðàêòåð.  îáëàñòè Ò3 ïðîìîòîðà îíà ñîäåðæàëà ôðàãìåíò ñîîòâåòñòâóþùèé 3’ ÷àñòè Ñ ñåãìåíòà êëîíà B1 ñ çàìåíàìè íåñêîëüêèõ íóêëåîòèäîâ.  òî æå âðåìÿ èñïîëüçîâàíèå äëÿ îïðåäåëåíèÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïðàéìåðîâ V è C îáëàñòè ïîêàçàëî, ÷òî ýòà âñòàâêà ñîäåðæèò äîïîëíèòåëüíî ïåðåñòðîåííûé ãåí ëåãêîé öåïè, ñîäåðæàùèé áîëüøóþ ÷àñòü V ñåãìåíòà è âòîðîé Ñ ñåãìåíò, îòëè÷àþùèéñÿ îò ïåðâîãî â îäíîé ïîçèöèè. Ïîñêîëüêó ïîêà íå óäàëîñü îïðåäåëèòü ïîñëåäîâàòåëüíîñòü â îáëàñòè ñòûêà ýòèõ äâóõ ôðàãìåíòîâ âñòàâêè, íåëüçÿ ñêàçàòü, íàõîäÿòñÿ ëè îíè â îäíîé èëè ðàçíûõ îðèåíòàöèÿõ. Ïî-âèäèìîìó, ñõîäíûé õèìåðíûé õàðàêòåð èìååò ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êëîíà D2 (äàííûå íå ïîêàçàíû).
ÑÐÀÂÍÈÒÅËÜÍÛÉ ÀÍÀËÈÇ ÏÅÐÂÈ×ÍÎÉ ÑÒÐÓÊÒÓÐÛ
Íóêëåîòèäíóþ è ïðåäñêàçàííûå àìèíîêèñëîòíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè êëîíà Â1 ñðàâíèâàëè ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè V è C ãåíîâ L-öåïåé Èà äðóãèõ âèäîâ ïîçâîíî÷íûõ (Ðèñ 12). Íà àìèíîêèñëîòíîì óðîâíå V îáëàñòü èìååò íàèáîëüøåå ñõîäñòâî ñ V-îáëàñòÿìè L-öåïåé êëàññà F è G ïåùåðíîãî ñîìèêà è ñ V-îáëàñòüþ L1 êëàññà Èà ôîðåëè (63-71%). È òå è äðóãèå îòíîñÿòñÿ ê êàïïà-òèïó L-öåïåé. Ïðè ïîèñêå ãîìîëîãîâ â ïîëíîì áàíêå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé Èà ìëåêîïèòàþùèõ ïåðâûå 100 ïîçèöèé ñ íàèáîëüøèì ñõîäñòâîì ïðåäñòàâëÿëè ñîáîé òàêæå V êàïïà îáëàñòè.
Ñ-îáëàñòü êëîíà Â1 èìååò íà àìèíîêèñëîòíîì óðîâíå ïðèáëèçèòåëüíî îäèíàêîâîå è íå î÷åíü çíà÷èòåëüíîå ñõîäñòâî ñ øèðîêèì ñïåêòðîì Ñ-îáëàñòåé L-öåïåé Èà õðÿùåâûõ è êîñòèñòûõ ðûá (41-44%). Íà íóêëåîòèäíîì óðîâíå íàèáîëåå áëèçêèìè ãîìîëîãàìè Â1Ñ ãåíà ÿâëÿþòñÿ ãåíû III êëàññà õðÿùåâûõ ðûá (65%).
ÀÍÀËÈÇ ÃÅÍÎÌÍÎÉ ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈÈ
Ãåíîìíóþ îðãàíèçàöèþ ëîêóñà ãåíîâ L-öåïåé Èà ñòåðëÿäè îöåíèâàëè ìåòîäîì Ñàóçåðí áëîò ãèáðèäèçàöèè. Ãåíîìíóþ ÄÍÊ âûäåëÿëè èç ïå÷åíè ñòåðëÿäè. ÄÍÊ ðàñùåïëÿëè ýíäîíóêëåàçàìè ðåñòðèêöèè Pst I è Pvu II. Ïîñëå ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ è ïåðåíîñà ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ íà íèòðîöåëëþëîçíóþ ìåìáðàíó ïðîâîäèëè ãèáðèäèçàöèþ â ìÿãêèõ óñëîâèÿõ.  êà÷åñòâå çîíäà íà V-ãåíû èñïîëüçîâàëè ôðàãìåíò, ïîëó÷åííûé â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ (ñì. Êîíñòðóèðîâàíèå áèáëèîòåêè êÄÍÊ è åå ñêðèíèíã).  êà÷åñòâå Ñ-çîíäà èñïîëüçîâàëè ó÷àñòîê êÄÍÊ êëîíà Â1, êîäèðóþùèé CL ñåãìåíò, êîòîðûé âûðåçàëè ïî ñàéòàì ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçàìè EcoR V-Xho I.
V-çîíä âûÿâëÿë áîëåå 20 ãèáðèäèçóþùèõñÿ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ, â òî âðåìÿ êàê Ñ-çîíä ãèáðèäèçîâàëñÿ òîëüêî ñ 3-4 ôðàãìåíòàìè (ðèñ. 13).
5' íåòðàíñëèðóåìàÿ îáëàñòü |> ëèäåðíûé ïåïòèä
1 15 30 45 60 75 90
B1 . .TTCATGGCAACA GAATCCACAACAACA ATGACTTTTATCAGC ATCTTCATCTGGGCA CTTGTCATCTGCACT CAGGAATCCAGTGGA
E4 CCC----A------- --------------- --------------- --------------- --------------- ---------------
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
|> V ñåãìåíò FR 1 |> CDR 1
105 120 135 150 165 180
B1 CAGTATACTGTGACT CAGACTCCAGCAGAG AAATCTGTTCTCCCA GGAGACACAGTCGCT CTCAACTGTAAAGTC AACAGCGCAGTCCTT
E4 --------------- --------G----T- --------------- ----------. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
|> FR 2 |> CDR 2 |> FR 3
195 210 225 240 255 270
B1V GGTAATACGTACCTG CACTGGTACCAACAG AAACCTGGAGAAGCT CCCAAACTCCTGATC TATAGGGCAAGTACC CTTGAGTCTGGGATC
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ---- ---C-----------
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . .------------ -----------A--- ---TAT----T--AG ---C-------N---
285 300 315 330 345 360
B1 CCAACTCGTTTCAGT GGCAGTGGATCTGGG ACTGACTTCACTCTG ACCATCAGTGGAGTC CAGGCTGAAGATGAA GGAGATTACTACTGT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------C----C- --------------- --------------- --------------- --------------- --------T------
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR --------------- ------------TT- --------------- --------------- -------------C- ---------------
|> CDR 3 |> J ñåãìåíò |> Ñ ñåãìåíò
375 390 405 420 435 450
B1 GTCAGTGTACACTAC TCCAGCAGTAGATAT GTGTTGACTTTCGGG CCCGGGACCAAACTA ATTGTGAAATCTGGA AGCCCCACTGCTCCT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 CAG---TC------- C----------C-G- -NCC-C--------A --A--------G--G G-------------- -A-------------
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR CAG---CAC---ACT C---ATG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
465 480 495 510 525 540
B1 TCCTCCGTCTCCCTG CTTCCTCCCTCCAAG CTGGAGCTCGACTCA AAGGGTAAAGCCACC CTGGTCTGCCTGGTG AATAATTTCTACCCT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------------- --------------- ------------A-- -----C--------- TG------------- --------------C
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -C--------- T-------------- --------------C
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
555 570 585 600 615 630
B1 GATGTCGTGGATATC AAGTGGACGGTGGAC GGGGTGGCCCAGTCG TCTGGTGTGCTGACC AGCACAATGAAGCAG AAGGATGGGAAATAC
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------------- --------------T ----C---------- --------------- --------------- -----C---------
C2(T3) --------------- --------------T ----C---------- --------------- --------------- -----C---------
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
645 660 675 690 705 720
B1 AGTGCAAGCAGCAGC CTGACCCTCACCAAG GCCGTGTGGAACAGC AAGGAGACATACACC TGCACTGTGAAGCAC GAGGCTGTGAGCACT
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
