Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина - Гистология, цитология и эмбриология, страница 7

Так, "Р используется для изучения мышечного сокращения — изменений содержания в тканях АТФ н неорганического фосфата. Изотоп "С позволяет с помощью ЯМР исследовать многие процессы, в которых участвует глюкоза. Использование ЯМР ограничено его низкой чувствительностью: в 1 г живой ткани должно содержаться не менее 0,2 мМ исследуемого вещества.

Преимуществом метода является его безвредность для живых клеток. 23 Микроэлектродная техника. Микроэлектроды представляют собой стеклянные трубочки, заполненные электропроводнгям раствором (обычно раствор КС! в воде), диаметр конца которых измеряется долями микрона. Кончик такой трубочки можно вводить в цитоплазму клетки через плазмолемму и определять концентрацию ионов Н', Ха', К', С1, Са", МВ, разность потенциалов на плазмолемме, а также производить инъекцию молекул в клетку. Для определения концентрации конкретного иона используют ионселективные электроды, которые заполняют ионообменной смолой, проницаемой только для данного иона.

В последние годы микроэлектродную технику применяют для изучения транспорта ионов через специальные ионные каналы (специализированные белковые каналы) в плазмолемме. При этом используют микроэлектрод с более толстым кончиком, который плотно прижимают к соответствующему участку плазмолеммы. Этот метод позволяет исследовать функцию одиночной белковой молекулы.

Изменение концентрации ионов внутри клетки можно определить с помощью люминесцирующих индикаторов. Например, для изучения внутриклеточной концентрации Са" используют люминесцентный белок акварин (выделен из медузы), который излучает свет в присутствии ионов Са" и реагирует на изменение концентрации последнего в пределах 0,5— 10 мкМ. Синтезнрованы также флюоресцентные индикаторы, прочно связывающиеся с Са". Создание различных новых типов внутриклеточных индикаторов и современных способов анализа изображений позволяет точно и быстро определять внутриклеточную концентрацию многих низкомолекулярных веществ.

Количественные методы В настоящее время наряду с качественными методами разработаны и применяются количественные гистохимические методы определения содержания различных веществ в клетках и тканях. Особенность количественно-гистохимических (в отличие от биохимических) методов исследования заключается в возможности изучения концентрации и содержания химических компонентов в конкретных структурах клеток и тканей.

Цитоспектрофотометрия — метод количественного изучения внутриклеточных веществ по их абсорбционным спектрам. Цитоспектрофлюориметрия — метод количественного изучения внутри- клеточных веществ по спектрам их флюоресценции или по интенсивности флюоресценции на одной заранее выбранной волне (цитофлюориметрия). Современные микроскопы — циглофлюоримел!ры позволяют обнаружить в различных структурах малые количества вещества (до 10еи — 10 " г) и оценить локализацию исследуемых веществ в микроструктурах. Интерферометрия.

Этот метод позволяет оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетках. С помощью этого метода, например, можно установить суммарное содержание белков в живых и фиксированных клетках. Методы анализа изображения клеточных и тканевых структур Полученные изображения микрообъектов в микроскопе, на телевизионном экране дисплея, на электронных микрофотографиях могут подвергаться специальному анализу — выявлению морфометрических, денситометрических параметров и их статистической обработке. 24 Морфометрические методы позволяют определять с помощью специальных сеток (Е. Вейбеля, А.

А. Глаголева, С. Б. Стефанова) число любых структур, их площади, диаметры и др. В частности, в клетках могут быть измерены площади ядер, цитоплазмы, их диаметры, ядерно-цитоплазматические отношения и др. Существуют ручная морфометрия и автоматизированная морфометрия, при которой все параметры измеряются и регистрируются в приборе автоматически. В последние годы все большее распространение получают автоматизированные системы обработки изображений (АСОИз), позволяющие наиболее эффективно реализовать перечисленные выше количественные методы для изучения клеток и тканей. При этом аналитические возможности количественной микроскопии дополняются методами анализа и распознавания образцов, основанными на обработке с помощью электронных вычислительных машин (ЭВМ) информации, извлекаемой из изображений клеток и тканей. По существу можно говорить об устройствах, не только усиливающих оптические возможности зрительного анализатора человека„но и многократно расширяющих его аналитические возможности.

Высказывается мнение, что АСОИз совершает такой же переворот в морфологии, какой около 300 лет назад произошел благодаря изобретению светового, а около 50 лет назад — электронного микроскопа, поскольку они не только неизмеримо повышают производительность труда исследователя и не только объективизируют наблюдения, но и позволяют получать новую информацию о невыявляемых ранее процессах, численно моделировать и прогнозировать их развитие в клетках и тканях. Вместе с тем участие в эксперименте ЭВМ требует от исследователя нового подхода к его проведению, владения навыками составления алгоритмов процесса исследования, точности рассуждений и в конечном итоге повышения научно-методического уровня исследования. Одним из методов, существенно расширивших число решаемых морфологических задач, является оптико-структурный машинный анализ (ОСМА), предложенный в 1965 г.

К.М.Богдановым. В 1978 г. автор метода был удостоен Государственной премии СССР. С появлением ОСМА сделан качественно новый шаг в разработке единой методологии количественного анализа микроструктур на основе статистических характеристик. В последнее время ОСМА нашел эффективное применение в исследовательской практике и народном хозяйстве. На рис. 2 представлена созданная в нашей стране фирмой «ЛОМО» автоматизированная система обработки изображений «Протва-М11». Система предназначена для проведения комплексных исследований клеток и тканей с использованием методов абсорбционной, флюоресцентной микроскопии и радиоавтографии. Входящий в состав системы специальный сканирующий оптический или электронный микроскоп осуществляет последовательный просмотр изображения препарата по двум координатам, преобразуя его в цифровую форму, и вводит в ЭВМ, которая в свою очередь производит цифровую обработку изображения и выдает информацию о геометрических и других характеристиках анализируемого объекта.

С помощью цветного дисплея исследователь может «препарировать» изображение, выделяя лишь те структурные составляющие, которые его интересуют. Входящие в состав ЭВМ емкие накопители информации на магнитных дисках или лентах Рис. 2. Автоматизированная система обработки изобра1кеиий «Против-М1!« ! — скаиируюао«й микроскоп-Фотометр; 2 — дисплей; 3 — ЭВМ, позволяют запоминать как сами изображения, так и результаты нх обработки лля последующего хранения и документирования.

Использование методов шпоматнзированного анализа мнкрообъектов рассмотрим на примере обработки изображения лейкоцита крови (рис, 3). Сканирующий микроскоп-фотометр позволяет построчно «просматрнватьь значения оптической плотности с шагом, заданным исследователем, В результате оптический сигнал, соответствующий оптической плотности ~бъе~та, преобразуется в цифровую фо)зму. Полученная цифр~~а~ матрица поллежит препаровке с помощью специального математического аппа)хпд.

Вначале убирается фон и аычлеияется «чистый«объект — изображение клетки (!а), затем из изображения клетки выделяется любая интересуюшая исследователя деталь, например цитоплазма (16) и ялро (1в), ЗВМ рассчитывает и строит гистограммы оптической плотности лля всей клетки (Па), лля ее цитоплазмы (1!6) и ядра (Ив). В полной гистограмме уае можно выделить фазы цитоплюмы и ядра. По гистограммам рассчитываются параметры 1 порядка: среднее и интегральное значение Оптической плотности, дисперсия, асимметрия, эксцесс и др.

По изображению объекта получают морфометрические параметры: плошаль, периметр, лнаметр, ялерно-цитоплазматическое отношение, козффициент ФОРМЫ И ДР. Следующим аталом обработки изображения является построение яву хм е рных диаграмм взаимозависимости О!ПнческОЙ !глотности для асей клетки (см. рис. 3)„ее цитоплазмы (И)б) и ядра (И!в). Так же, как и а первом случае, на лиаграмме всей клетки (1Иа) можно выделить фазу цитоплазмы и ядра Данные диаграммы позволяют рассчитать гистограммные параметры И порядка: гомогенность, лОкальный контраст, энтропию н лр.

Рвс. 3. Автоматизированная обработка изображения клетки (схема). Изображение лейкоцита (а), его цитоплазмы (б) и ядра (в). ! — цифровое изображение; П— гистограммы оптической плотности; (П вЂ” двухмерные гистограммы зависимости значений оптической плотности. Полученные таким образом параметры представляют многомерный «портрет» клетки и имеют конкретное числовое выражение. Они могут быть подвергнуты различным методам статистической обработки, позволяют предельно точно классифицировать микрообъекты, выявлять особенности их структуры, необнаруживаемые визуально. Таким образом, применение новых методов исследований в гистологии, цитологии и эмбриологии позволяет выяснить общие закономерности организации тканей и клеток, структурные основы биохимических процессов, определяющих функцию конкретных структурных компонентов клетки.