Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина - Гистология, цитология и эмбриология, страница 4

В настоящее время широко используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ) и сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ). С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е.

последовательно «ощупывает» остро сфокусированным электронным пучком отдельные точки поверхности. Для исследования выбранного участка микрозонд двигается по его поверхности под действием отклоняющих катушек (принцип телевизионной развертки). Такое исследование объекта называется скан и р ованием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд,— растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом. Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

Электронная микроскопия по методу замораживания — скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межхлеточных соединений. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре ( — 160'С). При исследовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии. Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помешают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при — ! 60 'С. Метод электронной микроскопии «замораживание — травление» применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток.

После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур. ' Гяаилулояиты яичка. Таким образом, методы замораживания — скалывания и замораживания— травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией. Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, крупных белков (например, миозин).

При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити). Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом криаультрамикротамии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре — 196 'С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности ферментов, а также дпя проведения иммунохимических реакций. Для выявления анти- генов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализацию которого легко выявить на препаратах. Методы сверхвысокавалыпнай микроскопии. Используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В.

Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1 — 10 мхм), так как при высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,5 нм). Рентгенаструктурный анализ, Для изучения структуры м а к р о м о л е к у л на атомарном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину волны около 0,1 нм (диаметр атома водорода). Молекулы, образующие кристаллическую решетку, изучают с помощью дифракционных картин, которые регистрируют на фотопластинке в вьще множества пятен различной интенсивности. Интенсивность пятен зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение.

Положение пятен в дифракционной картине зависит от положения объекта в системе, а их интенсивность свидетельствует о его внутренней атомной структуре. Методы исследования фиксированных клеток и тканей Исследование фиксированных клеток и тканей. Основным объектом исследования являются гистологические препараты, приготовленные из фиксированных структур. Препарат может представлять собой мазок (например, мазок крови, костного мозга, слюны, цереброспинальной жидкости и др.), отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки), тонкий срез.

Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют слабый контраст, они плохо выявляются в обычном световом микроскопе и требуется использование специальных микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препараты. Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация, 2) уплотнение материала, 3) приготовление срезов, 4) окрашивание или контрастирование срезов. Для световой микроскопии необходим еше один этап — заключение срезов в бальзам или 16 другие прозрачные среды (5).

Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения.

Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей. Уплотнение кусочков, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например в жидкой углекислоте.

Приготовление срезов производится на специальных приборах — микро- томах (для световой микроскопии) и ультрпмикротомах (для электронной микроскопии). Окрашиваиие срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования.

Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее известный основной краситель азур Н, который окрашивает ядра в фиолетовый цвет, и кислый краситель— эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-оранжевый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами.

Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильиыми (ацидофильными„эозинофильными), а окрашивающиеся основными — базофильоыми. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и по- кровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет. Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, ко нтрастируют солями марганца, кобальта и др., после чего просматривают в микроскопе и фотографируют.

Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами. Методы исследования живых клеток и тканей Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности — проследить движение, процессы 1т деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток, продолжительность их жизненного цикла, реактивные изменения в ответ на действие различных факторов. Прижизненные исследования клеток в организме (!и что). Одним из прижизненных методов исследования является наблюдение структур в живом организме.