Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 15

Эрбстатнн ингибирует тирозиикиназу рецептора ЭФР и тирозинкиназы семейства Бгс (1йпегаща е! а!., 1986). Ранее считали„ что эрбсткгин и его стабильный аналог метил-2,5 — лигидроксициннамат конкурируют с белковыми субстратами за взаимодействие с тирозинкиназами (()щщазча ег а)., 1990; Саяне!йе, 1991), однако нелавно было обнаружено, что они могут конкурировать как с субстратами, так и с АТФ (1 сч!1хЫ, СаЫ1, 1995). Атроплитинин-1 он Лаиенлустии А Геннстейн сн,о он Гербиницнн А '! ирсуостины Рис. 21. Структура иигибиторов тирозиикииаз.

он ц.а. но о н " ~:;~='ъ Эрбстатин тв Природные ингибиторы тирозннкиназ послужили отправной точкой и прекрасной моделью для разработки новых синтетических блокаторов тирозинкиназ. Левицкий и Разит (Уа)ьй ег а)., 1988; Оеяй ег а)., 1989„. 1 ее!1х(п', 1992; 1 еэч)ыЫ, бага, 1995) разработали высокоэффекгивные и селективные синтетические ингибиторы тнрозинкиназ, которые получили общее название "тирфостииы" (рнс. 21). В основу тирфостинов была положена структура самого маленького нз известных природных блокаторов тирозинкиназ, зрбстатина, и структура тирозина.

Исследования показали, что тирфостины могут успешно использоваться для лечения многих пролнферативных заболеваний. Классическими ингибиторами тирозинфосфатаз являются оргованадат Ыа ()ЧазЪ'04) (Ззчагор е! а!., 1982а, 1982Ь; Ооп)оп, 199!), перванадат, молнбдат, Еп (Ьйзсйег е! а1., 1991; зуа)гоп, Р!хоп, 1993). Ортованадат Ыа ингнбирует все группы тирозинфосфатаз в концентрации 10-!00 мкМ, в то время как молибдат действует в более высоких концентрациях.

В каталитическом домене всех известных тнрозиифосфатаз, как цитоплазматнческнх (ВагТогг( е1 а1., 1994; (уели ег а1., 1996), гак и рецепторных (РгасЬег е1 а1., 1991; Фа(зоп, О!хоп, 1993) выявлен функционально важный остаток цистеина, который должен быть в восстановленном состоянии для осуществления фосфатазной активносги. В последнее время обнаружены цитоплазматическне тирозннфосфатазы РТР!С и РТР1О, содержащие два БНз-домена, которые связьваются с фосфорилированиыми остатками тирозина беяков.

Эти ЯНз-домены, содержащие остатки цнстеина, позволяют тнрозинфосфатазе связываться с фосфорнлированиыми белковыми субстратами и обеспечивают, по-вндимому, определенную локаяизацню тирозннфосфатаз в клетке. Таким образом, остатки цисгеина в яз†доменах и консервативный остаток цистенна в каталитичсском домене тирозинфосфатаз могут быть мишенями яля ковалентиой модификации сульфгнлрильнымн реагентамн. Так, фениларзиноксид, являкяцийся производным трехвалентного мышьяка (СьНгАзО), предпочтительно и ковалентио связывается с соседними или бянжайшимн ЗН-группами, встречающимися во фрагментах белка типа -Суз-Х-Х-Суз- (ФеЬЬ, 1966).

Относительно недавно бьшо обнаружено, что фениларзиноксил является эффективным блокатором тирозинфосфатаз (алас е! а1., 1991; Ь)ег)еша ег а!., 1991). Установлено также. что другой ингибитор тирозинфосфатаз— ортованадат Ыа - блокирует тирозинфосфатазу РТР1О в гепатоцитах крысы, окисляя, по-вндимому, БН-группы в активном центре фермента. В пользу этого свидетельствует обратимость эффекта ортованадата На при действии восстанавливающего агента днтиоэритреитола (Рцйатйепгй! ег а!., 1996). Показано также, что другие агенты (напрнмер, Нзб ).

которые окисляют ЯН-группы, также могут ингибировать тирозннфосфатазы (Несйг, 2!сй, 1992; Сазейй е! а1„1998; Еее е! а)., 1998). Так, Ы- пилмалеимнд и иодацегат„необратимо алкилнруюшие 8Н-группы, эффективно блокируют активность тирозинфосфатаз (Ро1 ег а!., 1991; Гчайоп, О!хо1ч. 1993). Обнаружено, что фениларзиноксид, згилмалеимил н Нзб оказывают сушественное влияние на процессы Са скглализации в пернтонеальных макрофагах крысы: вызывают дозоз зявкснмое повышение !Са '), в клетках, обусловленное мобилизацией Са ю депо и входом Са из наружной среды (Крутецкая и др., 1997б). 4.4лй Модуляция активности ионных каналон тнрозиикинязами и чирозггифосфатвзаьги Ионные канаяы клеток представляют собой гликопротеины, арогв~зываюшне мембрану.

Известно, что существует множество механизмов модуляции свойств белковых молекул. Одним из наиболее широко распространенных механизмов регуляции активности белковых кояекул являеч.ся их фосфорилнрование различными кнназами ((.ет!1ап, 1985, 1988, 1994: Н|йе, !992; )згпайож Вепоз. 1995). гросфорилирование белков по остаткам серина, треонина н тирозина является универсальным веханизмом регуляции функционирования белков и клеточных к)хчцессов, в которых зти белки участвуют.

В настоящее время яоакточно хороню изучена модуляция акгнвности различных типов конных каналов серннГтреонииояьгми киназамн, такими как ПКС, Г1КА и Га-кальмодулин-зависимая !гиназа (!.ет!гад, 1985, 1994; НИ1е, 1992; Сшгегай, 1988, 1993, 1995, 1996). Сравнительно недавно появились данные, свидетельствующие о роли тирозинкиназ и тнрозинфосфатаз в вггуляшчи активности ионных каналов (Бчторе ег а1., 1992, 1995; бкбе!Ьашп, 1994; )опав, Касзпчаге)г, 1996; обзор Кругецкая, Лебедев, 1998; Рак!з еГ а1, 2001).

В последнсе время обнаружено, что активность разных типов конных каналов в различных объектах эффективно модулнруется рецепторными и ци.юплазматическими тирозинкиназами и чярозннфосфюазами (Крутецкая, Лебедев, 1998). Мишенями для тярозиньиназ и тирозинфосфатаз являются: потенциал-зависимые К -, Иа - и Са'-каналы (Нцапб ег а1., 1993; Регайа, 1995; Кцза)га, бреге!а!г!з, !996; Ж!)езопбе е! а)., 1992; %!)езгчп8е, Нн8Ьез, 1995а, 1995Ь); Са шпнвируемые К -каналы (Ргекагзйауа ег а1.„1995); лигацп-управляемые ыначы ХМОА-рецепторов, никотиновых ацетилхолиновых рецепторов и ГАМКа-рецепторов (Бччоре ег а!., 1992„ 1995); 1Р,-чувствительные каналы Са '-выброса ()ауагашап е1 а!., 1996); СГ-каналы (Бого!а, 1995)„каналы шалевых контактов (Сап ег а(., 1996); рецептор-управляемые Са -каналы (багбевп! е! а)., ! 993в, 1993Ь: Крутецкая и дрл 1997а).

Известно, что тирозинкиназы играют важную роль в процессах сигнализации в клетках иммунной системы ().ек!!АЗЫ, Сахй, 1995). Установлено, что ингибиторы тирозинкиназ блокируют активацию В- и Т-лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и макрофагов (Соййпап е! а)., 1994; 1)асй)ш е! а)., 1997). Нами показано, что два структурно различных ннгибитора тирозинкиназ генистейи и метил-2,5-дипщроксиципиамат ингибируют вход Са, индуцируемый пуринерггшескими агонистами (АТФ, УТФ) и иигнбиторами эндопяазматических Саэ'-АТФаз (тапсигаргин, циклопьязониковая кислота) в перитонеальиык макрофшвх крысы (Крутецкая и др., 1997а; Крутецкая, Лебедев, 1998). С помощью метода пэтч-клэмп в конфигурации "ьгпо(е-сеП" на перитонеальных макрофагах крысы установлено„что внеклеточное приложение генистейна (100 мкМ) или метил-2,5-дигидроксициннамата (100 мкМ) приводит к быстрому и значительному (на 40 58) подавлению пиковой амплизулы К -токов выходящего выпрямленна при всех значениях мембранного потенциала (Кругецкая, Лебедев, 1998).

1!осле воздействия иигибиторов тирозинкиназ иабшодается также существенное ускорение кинетики К'-инакгивации. Ингибируюшее действие агентов практически полностью обращаегся при отмывании кле~ок в контрольном растворе. Чтобы иоключи!ь возможность прямого блокирующего действия генистейна на К'-каиалы, было исследовано влияние дайдзейнаструктурного аналога генистейна, не способного ины!бировать тирозинкиназы.

Установлено, что дайазейн (100 мкМ) не оказывает существенного влияния на харакгеристики К -пжов. Это позволяет предположить, что ингибирование К'-токов под действием генистейна и метил-2,5-дигидроксициинамата может быль связано с блокированием эндогенных тирозинкиназ. В то же время, ингибиторы тирозинфосфатаз ортованадат )4а (50 мкМ) или фениларзиноксид (100 мкМ) вызывает увеличение амплитуды К -токов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о важной роли фосфорилирования по тнрозииу в регуляции активности потенциал-зависимых К -каналов в мембране перитонеальиь!х макрофагов крысы (Крутецкая, Лебедев, 1998).

Кожа амфибий и ьючевой пузырь амфибий являются удобными модельными объектами для выяснения механизмов трвнсэпителиального транспорта ионов, а также исследования модуляции транспорза различными фармакологическими агентами и системами вторичных посредников. Инсулин стимулирует трансэпителиальнын транспорт Ха" в ряде эпителиальных систем: коже амфибий, мочевом пузыре амфибий, клетках почки.

Для выяснения механизмов действия инсулина на трансгюрт )4а в коже лягушки мы использовали автоматизированную установку фиксации потенциала и регистрировати вольт-амперные характеристики кожи лягушки Кала !епзрогапа (Крутецкая, Лебедев, !998). Показано, что инсулин (0,5-1 мкМ), добавленный в раствор, омывающий базолатеральную (серозную) поверхность кожи„существенно увеличивает ток короткого замыкания (1„). Увеличение 1„ сопровождалось сдвигом .граисэпителиального потенциала (У,„) кожи в сторону гиперполяризации и увеличением полной зрансэпизелиальной проводимости (8„). Эффект инсулина развивался через 15-30 минут. В присутствии блокатора эпителиальных г1а -каналов амилорида (10 мкМ) инсулин не вызывает увеличения 1, что свидетельствует о том, что инсулин увеличивает преимущественно ал~илорид-чувствительную компоненту тока короткого замыкания. Результаты наших исследований, а также данные, полученные на коже лягушки (Вс)юеп, Ег!0, 1987), эпителиальных клетках почки (Маьэпнпо!о е! а1., 1993) и клетках эпителия легких крысы (Пай!зчага ег а1., 1992), свидетельствуют о том, что инсулин сзнмулирует транспорт Ха через амилорид-чувствительные )Ча -каналы в апикальной мембране зпителиальных клеток.

В пользу этого свидетельствуют полученные нами данные о том, что инсулин преимущественно увеличивает амилорндчувствительную компоненту тока короткого замыкания в коже лягушки. В то же время, нельзя исключить вазможность того, что инсулин стимулирует также активность г!а'-К'-АТФазы, локализованной в базальной мембране. Однако, активация г!а'-К'-АТФазы является вторичным процессом по отношению к вызываемому инсулином увеличению внутриклеточной концентрации ионов гча', ()ча'),. таким образом, можно предположить, что инсулин стимулирует транспорт г!а через апикальную мембрану клеток, что приводит к увеличению ()ча )й повышение (Ха ), вторично вызывает акгнвацию )Ча -К -АТФазы.

Такой механизм действия инсулина был предложен для ряда объекгов (Еэчагг, Кбр, 1995). Инсулин связывается с рецепторами, имеющими собственную тнрозинкиназную активность. Рецепторы инсулина локализованы, повидимому, преимущественно в базолатеральной мембране эпителиальных клеток. Многие из эффектов инсулина связаны с активацией его рецепторной тирозинкнназы. Вместе с тем, нельзя исключить возможное участие в действии инсулина цитоплазматическнх тирозинкиназ. С использованием ингибиторов тирозинкиназ мы исследовали возможную роль тирозинкиназ в действии инсулина. Природный специфический ин~нбитор тирозинкиназ изофлавоноид генистейн конкурентно блокирует связывание АТФ с тирозинкиназами.

Стабильный аналог эрбстатина метил-2,5-дигидроксициннамат конкурирует с белковыми субстратами за связывание с тирозинкиназамн, Показано, гго предварительная обработка (в течение часа) апикальной поверхности кожи генистейном (100 мкМ) или метил-2,5-дигцдроксициннаматом (10-20 мкМ) значительно ослабляет, а в некоторых случаях практически полностью предотвращает последующее действие инсулина.