Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 16

Это свидетельствует о том, гго стимулирующее влияние инсулина на трансэпителиальный транспорт На' в коже лягушки связано с активацией тирозинкиназ. Кроме влияния на индуцируемый инсулином транспорт На', генистейн и метил-2,5- дигидроксициннвмат также уменьшают базальный уровень 1„, что свидетельствует о роли тнрсоинкиназ в модуляции транспорта Иа в коже лягушки. Ингибитор тирозинфосфатаз, ортованадат На (20-60 мкМ), усиливает эффект инсулина. Полученные данные позволяют заключить, чго фосфорилирование белков-мишеней по тирозину играет важную роль в регуляции трансэпителиального транспорта !4а в коже ля~ушки в оз.вет на приложение инсулина (Крутецкая, Лебедев, 199!!).

Таким образом, анализ последних экспериментальных данных свидетельствует о том, что активность самых различных типов ионных кшшлов в целом ряде типов клеток эффективно модулируется рецепторнымн и цитоплазматическими тирозинкиназами и тирозинфосфатазами. 4.5. Гуаиилатцнклазиап система Циклический гуанозин-3',5'-монофосфат (цГМФ) является еще одним циклическим нуклеотидом, влияющим на процессы Сасигиализации в различных типах клеток.

Хотя цГМФ был обнаружен в !963 г. (Аз)запал е! а!., 1963), а гуанилатциклаза, ккгализирующая синтез цГМФ из Мк-ГТФ, была открыта в 1969 г. (Нап!пжп, Ьо!пег!апд, 1969), только в конце семидесятых и восьмидесятых годов была установлена важная роль гуанилатциклазной системы в фогорецепторах и гладких мышцах. В настоящее время показано, что цГМФ опосрелует эффекты широкого спектра гормонов, натрийуретических пептидов, лекарственных средств и токсинов в различных типах клечок (1лпсо!п, Со!имей, 1993; бсЬп!г(1 е! а!., 1993). Синтез цГМФ осуществляет фермент гуанилатциклаза (ГЦ), Выделяют два типа ГЦ: связанные с мембранами рецепторные ГЦ н растворимые или цитоплазматическне ГЦ (Ясппибг е! а1., 1993). Рецепторные ГЦ активируются пептидными лигандами, которые связываются с мембранными рецепторами, имеющими трансмембранный домен и цитоплазматическнй домен. облалаюший гуанилатциклазной активностью. В тканях человека и крысы идентифицированы 3 типа рецепторных ГЦ.

Натрийуретический пептид из предсердия и натрийуретический пептид из мозга связываются с рецецторной ГЦА. Натрийуретический пептид типа С взаимодействует с ГЦВ. Рецепторные ГЦ третьего типа, называемые также ГЦС, активнруются термостабильным энтеротоксииом из Е. сой н обнаруженным недавно эиаогенным кишечным пептидом гуаннлином. Растворимые ГЦ представляют собой гетеродимер из а- и [1- субъединиц (бсйпз(г(! ег а!., 1993). Мол. масса растворимой ГЦ из разных тканей составляет около 150 кДа.

Растворимая ГЦ активируется новым внутриклеточным и межклеточиым мессенджером — короткоживушей мембранапроницаемой молекулой окиси азота()ЧО). Через образование эндогенной 1чО действуют широко применяемые лекарственные средства - нитроглицерин, нитропруссид Ха, нитросорбнд (Мопса>1а е! а1., 1991). Цитозольнвя форма ГЦ ингибируется известным красителем мегнленовым голубым (метиленовой синькой), б-анилино-5, 8-хинолиндионом (соединением (.'г'83583).

Также как и цГМФ, 1чО играет важную роль в регуляции процессов Са '-сигнализации н Са '-гомеостаза в различных типах клеток (С)епзеп!1 ег а1., 1995а, 1995Ь; С(етеп!1, 1998). В клетках млекопитмоших )ЧО синтезируется из 1.-аргинина с помощью ферментов )ЧО-синтаз. Вьшеляют три изоформы лого фермента: 1, И и И! (8сЬппгй ег а!., 1993). 110-синтаза! типа (Ъга>п-!уре, мол. масса ! б0 кДа) и Ь)О-синтаза 1И типа (епг)огйейцгп-!уре, мол.

масса 133 кДа) являются конституитивными, постоянно экспрессированы во многих тканях; активируются после взаимодействия с Са~ и кальмодулииом. ь(О-синтаза И типа(гпасгорЬайе>уре, мол. масса 130 кДа) нечувствительна к Са н являе>ся нндуцибельной, экспрессируется после иммунологической активации клеток цитокинами, такими как интерфероны, интерлейкин-1, фактор некроза опухолей, а также бакгериаэьными липополисахарилами. Глюкокортикоиды и некоторые интерлейкины (интерлейкин-4 и я>перлейкин-1О) ингибируки индукцию !чО-синтазы И типа (МасМ(с(г(п8 ег а1., 1997). Все изоформы )ЧО-сии>яз являются гомодимерами из субвединиц с мол. массой !30-160 кДа. Каталитические участки всех изоформ )чО- сиитазы включают цитохром Р."„-подобный домен и домен, связываюший (;аргииин.

К регуляторным участкам относятся кальмодулинсвязывающий фрагмент и различные участки фосфорилирования. Все изоформы 1ЧО-синга>и связывают кальмодулин Са -зависимым (!чО- синтазы ! и Ш типов) нли Са -независимым (ХО-синтаза И типа) образом. )ЧО-синтазы! и Ш типов связывают кальмодулин и полностью атнвируются при повышении [Са' ),. Антм онисты кальмодулина, кальмидазолий и трифторперазин, блокируют связывание кальмодулина и ингибируют вызываемое увеличением [Са '1, образование 1ЧО.

>ЧО- синтазы И т>ша изолированы из клеток печени и макрофагоподобных клеточных линий (8сЬпп>й ег а!., 1993]. Подобно Ь(0-сннтазам ! и Ш типов, (ЧО-синтаза И типа из клеток печени активируется при связывании 2+ с кальмодулином. но этот процесс не зависит от [Са )к В то же время, )ЧО-синтаза П типа из макрофагов постоянно связана с кальмодулнном и постоянно находится в активном состоянии (МасМ)с)г!пб ег а)., 1997).

Ингибиторами Ь)О-синтаз являются неутилизируемые аналоги аргннинв, например, )Ч-литре-Е-аргпнин (1.-)ЧА) и !.-)Ч-(1-иминозтил)-орнитин (1.- )Ч)О) (Хп ег а1., 1994; С! егпепй ег а!., 1995 Ь). Таким образом, актнвированная 71О-синтаза каталнзирует образование 140 из 1.-аргинина. НО активирует цитоплазмкгическую ГЦ, катализируккцую образование цГМФ. В клетках эукариот выявлены 3 основных типа внутриклеточных рецепторных белков, с которыми взаимодействует цГМФ: цГМФ-зависимые протеинкиназы (прозеинкнназы О), цГМФ-регулируемые ионные каналы и цГМФ- регулируемые фосфолизсгеразы (1лпсо!и, Согпше)1„1993; бсЬш(г)1 е1 а1., 1993). Протеинкиназа О была идентифицирована в 1970 г.

(Кцо, Огеепйап), 1970). Протеинкииаза О менее широко распространена, чем ПКА. Максимальная концентразия протеинкиназы О обнаружена в легких, мозжечке, гладких мышцах, тромбоцгитах (Ггапсй, СогЬ!и, 1994). Показано, что по структуре и функции протеинкиназа О гомологична ПКА. Как н ПКА, протеинкиназа О фосфорилирует белковые субстрвты по остаткам серина нли треонина (Ргапс)з, Согб!и, 1994). В клетках позвоночных идентифицированы два основных класса протеинкцназ О: ! и В типа (Ыпсо!гь Согпие!1, 1993; бсЬшЫ1 ег а1., !993; Егапсй, СогЬ!п, 1994). Протеинкиназа О1 является в основном цитоплазматнческой; гшентифицирована в гладких мышцах, тромбоцнтах, мозфечке, миоцитах сердца, нейтрофилах.

Протеинкиназа ОВ связана с плазматический мембраной и обнаружена только в эпителиальных клетках кишечника. Г!ротеннкнназа О! представляет собой гомодимер из двух идентичных субъеднниц с мол. массой 78 кДа. С каждым мономером связываются две молекулы цГМФ. В отличие от ПКА, каждая субъединица протеннкиназы О содержит н регуляторную (связывание цГМФ) и каталитнческую (связывание белковых субстратов) як~явность.

Каждая субъелиница (670 аминокислот) протеннкиназы О1 имеет следующие функциональные домены, начиная с Х-конца молекуяы: домен, участвующий в димеризацин субъединиш домен, содержащий участки аутофосфорилирования; два домена, связывающих цГМФ с низким и высоким сродством, соответственно; домен, связывающий М8 /АТФ, домен, взаимодействующий с белковыми субстратамн, и обеспечивающий каталитнческую функцию; С-терминальный домен. Азп- 483 в каталитическом домене играет ключевую роль в переносе у-фосфата с АТФ на остатки серина нли треонина белковых субстратов.

Вьшвлены две изоформы протеинкиназы Ой !и и Ц), отличающиеся 100 аминокислотами на Ь(-конце молекулы. Протеинкиназа ОП представляет собой мономер с мол. массой 86 кДа; с мономером связывается 1 молекула цГМФ (Вбпсо!и, Согпзче!!., 1993; Вобл|ай е| а(., 1993; Ргапсп, СОГЬ|п. 1 994). Функциональная роль пр|ггеинкиназы С|1 наиболее изучена в клетках гладких мыши„ тромбоцитах и нейтрофилах. Так, обнаружено, что активация протеинкиназы С! приводит к уменьшению (Са ), в клетках гладких мышц (1лпсо!п, Гоппкей. 1993). Предполагагот, что это может быть связано с активацией Са -АТФаэы в плазматической иембране и в мембране саркоплазматического ретикулума.

В тромбоцигах человека активация протеинкиназы О! также приводит к лода|шению индуцнрусмого а|оннсгами повышения (Са )„что может быть обусловлено ингибированием ФЛС (Ое!8ег е| а(., 1992, 1994). Для иейтрофилов человека выявлено участие протеннкпназы О! в регуляции процессов хемотаксиса и дегрануляции (Ъ'уап е| а1., 1991). Обнаружено, что активация ней|рофилов хемотактическим пептидом формилме|полил-лейцнл-фенилаланином (!МВР) или Саз'-ионофором А23187 приводит к существенному повышению (Са~')„которое стимулирует образование ХО. )40 активирует ГЦ, югшлизирующую образование цГМФ. Повышение (Са~), вызывает поляризацию нейтрофилов и колокап|зацню протеинкиназы О! с белком цитоскелета виментином. После этого акгивированная цГМФ протеннкиназа О! может катализировшь фосфорилирование вимеитина.

Локализация протеинкиназы О( и виментина коррелирует с его фосфорилированием, поляризацией и дегрануляцией нейтрофилов, что свидетельствуег об участии в этих процессах протеинкиназы О1 (%уап е1 а(., 1991). Вышеизложенное указывает на то, что подобно друтим серинтреониновым киназам, протеинкиназа О! связана с субклеючными структурами, в частности со структурами цитоскеле|а в клетках эукариот. «Заякориваниев протеинкиназы О! около соответствующих субстратов в определенных участках клетки позволяет определенным внеклеточным сигналам вызывать быстрое и эффективное фосфорилироввние белков прзгеинкиназой О!. Функциональная роль цГМФ наиболее хорошо изучена в фоторецепторных системах.