Крутецкая, Лебедев, Курилова - Механизмы внутриклеточной сигнализации - 2003, страница 11

Несмотря на то, что моноцнты периферической крови, альвеолярные макрофаги и перитонеальные макрофаги имеют общего предшественника н аыполнюот сходные роли, они находятся !и 9!го в различном окружении и имеют в связи с этим морфологические и функциональные различия, включая различна в метаболизме АК. В пернтонеальных макрофщах человека нонофор А 23187 или экзогенная АК стимулнрукгг 5-лнпоксигеназный путь окисления АК с образованием 5-гидроксиэйкозатетраеновай кислоты.

лейкотриена В, и лейкотриена С, (Еаь(о1еце ег а)., 1988). Этот профиль продуктов липокснгеназного пути окисления АК для пернтонеальных макрофагов сходен с таковым для моноцитов периферической крови человека, стимулированных ионофором А23187. В то же время, альвеолярные макрофаги, активированные А 23187, продуцируют только 5-гидроксизйкозатетраеновую кислоту н лейкотриен Вх, но не лейкотриены Сз, Р, илн Ех. Как отмечалось ранее, характер метаболическнх превращений АК в большой степени зависит от типа используемого стимула. В работе Брауна н др.

(Вгоюп е! а!., ! 988) исследована возможность избирательной стимуляции циклооксигеназного или липоксигеназного путей окисления АК в альвеолярных макрофагах человека Обиарукено, что липополисахарид из Е. со!1 избирательно стимулирует циклооксигенаэный путь окисления АК: продуцируются простагландины Рз, Ез, Гз, тромбоксан Вз и гидроксигептадекатрнеиовая кислота. Продукты липоксигеназного пути окисления АК не были идентифицированы, даже в присутствии ингибнторов циклооксигеназы (индометацин).

Нап!ютив, Саз'-ионофор А 23187 избирательно стимулирует липокснгеназный путь окисления АК в альвеслярных макрофагах человека, при этом образуются метаболиты 5-липоксигеназы лейкотриен В„и 5-гидроксиэйкозатстраеновая кислота. Продукты циклооксигенвзного пути окисления АК прн этом не были идентифицированы, даже в присутствии ингибиторов лнпоксигенаэ (нордигидрогуаретиковая кислота). Эгн данные свидегельствуют о том, что в альвеолярных макрофагах человека можно избирательно стимулировать липоксигенаэный или циклооксигеназный пугн окисления АК (Вгозчп е! а!., !988). Сходные данные получены ранее на перитонеальных макрофагвх мыши (Бсоц е! а1., 1980; Нпп1еэ еГ а1., 1982). В присутствии ингибиторов одного из путей, ие наблюдается переключения на альтернативный путь окисления АК.

В последнее время внимание исследователей привлекает не только АК, но и другие ЖК, не являющиеся субстратом для циклооксигеназ и липокснгеиаэ. 4.3,4, Жирные кислоты и модуляция активности ионных каналов АК и другие ЖК являются важными структурнымн компонентами мембранных липидов. В настоящее время известно более 200 жирных кислот, отличающихся по длине углеводородной цепи, степени и характеру ее разветвления, числу н положеншо двойных связей, природе и количеству других функциональных групп.

ЖК, входящие в состав фосфо- и глнколипндов мембран эукариот, содержат от 12 до 24 атомов углерода. Подавляющее большинство ЖК имеет, как правило, четное ЖК могут быль насыщенными (не содержащими двойных связей) и ненасыщенными (содержащими одну или более двойных связей).

Насыщенные ЖК имеют длинную неразветвленную цепгд их общая формула СНз(СН )„СООН. В мембранах клеток животных наиболее часто встречаются насьнценные ЖК с 14, 16 и !8 углероднымн атомами: миристниовая (14:О) (рис. !6), пш!вы!!типовая (16:О) и стеаршювая !18:О) кислоты (Марри и др., 1993). Ненасыщенные ЖК подразделяют в соответствии со степенью ненасыщенности на мононенасыщенные (моноеновые, одна двойная связь) и полиненасыщенные (полиеновые, несколько двойных связей) кислоты. Цис-двойная связь в моноеновых ЖК находится, как правило, между 9-м и 1О-м атомами углерода (реже между 11-м и 12-м).

Обычно ненасыщенные цепи присоединяются ко второму атому углерода остатка глицерина глицерофосфолипидов мембран. Общее же число двойных связей может достигать шести (гексаеновые кислоты). Все двойные связи в ненасыцзенных ЖК, обычно встречающихся в тканях млекопитающих, имеют цис-конформацию (Марри н др., 1993). Атомы углерода в молекуле ЖК нумеруюгся, на ~иная от карбокснльной группы. Атом углерода, следующий за карбоксильной группой (углерод 2), называют также а-углеродом. Атом углерода 3 — зто Р - углерод, а углерод концевой метильной группы (углерод и) - щуглерод.

Для указания числа двойных связей и их положения были приняты различные соглашения, например Л означает, что двойная связь 9 в молекуле жирной кислоты находится между атомами углерода 9 и 10, считая от карбоксильнога конца; ~в9 — двойная связь находится у девятого атома углерода, считая от концевой метильной группы. В ЖК животных организмов в процессе метаболизма могут вводиться дополнительные двойные связи, но всегда между уже имеющейся двойной связью (например гв9, геб или озЗ) и карбоксильным углеродом; это приводит к разделению ЖК на 3 семейства животного происхождения - гвЗ, геб или щ9(Марри и др., 1993). Основную долю ненасыщенных ЖК в липндах мембран животных клеток составляют олеиновая (ге9, 18:1, Л ), линолевая (вб„!8:2, ЛК ' ), алиноленовая (геЗ, 18:3, Л' ' ' ), арахндоновая (шб, 20:4, Л' к " и), докозатриеновая (геЗ, 22:3, Л ' ' ' ' ) кислоты (рис.

! 6). АК (эйкозатетраеновая кислота) является цнс-полиненасыщенной ЖК, содержит 20 атомов углерода; четыре дяойные связи расположены у 5, 8, ! ! и !4 атомов углерода, считая от карбоксильного конца; относится к семейству гвб. Арахидоновая, линолевая и а-линоленовая кислоты называются незаменимыми ЖК, необходимыми для полноценного питания многих видов животных и человека !Марри и др., 1993). Свободные или неэсгерифицированные ЖК освобожлаются из фосфолипидов мембран в результате рецепторзависимой или рецепторнезависимой активации фосфолипаз.

Экзогенные ЖК мокнут также доставляться к клеткам, будучи связанными с альбумином и липопротеинами сыворотки крови. Именно свободные ЖК могут играть роль первичных или вторичных посредников, непосредственно иодулирующих активность различных эффекторов в клетке, в первую очередь ионных каналов (Огг(эчау ег а!., 1991; Меркез, 1994; Кругецкая, Лебедев, ! 995, 2000а). Регуляция активности ионных каналов непосредственно ЖК показана для разных типов ионных каналов в различных объектах (см обзоры: ОггЬлау е! а!., !991: Мечез, 1994; Крутецкая, Лебедев, 1995, 2000а).

Мишенями для ЖК являются: потенциал-зависимые К'-, На"- Са"-каншэьк Са -активируемые К -каналы, лиганл-управляемые каналы 1ЧМОА- и ацетилхолиновых рецепторов, 1Рэ-чувствительные каналы Са '- выброса, С(-каншэы, каналы щепевых контактов. Эффективными модуляторами активности ионных каналов оказались представители цисполиненасыщенных, транс-полиненасыщеиных, цис-мононенасыщенных и иасьпценных ЖК. Предполагают., что алтивные ЖК должны быль настолько пшрофильными, чтобы допивать эффективной концентрации в водном растворе, и вместе с тем настолько гидрофабнымн, чтобы взаимодействовать с гидрофсбным участком белка >щи липида. Примерам прямой модуляции активности ионных каналов ЖК является влияние АК и других ЖК на потенциал-лзвисимые К'-каналы в перитонеальных макрсфагах крысы.

В последние годы в режиме локальной фиксации потенциала в конфигурации "гч(эо(е-сеП'* нами показано, что аьгивность К -каналов выходящего выпрямления в мембране перитонеальных макрофагов крысы мсдулируется свободными ЖК (Крутецкая п др., 1995а, 1995о; Кхшеийауа ег а1., 1994; Крутецкая, Лебедев, 1998). Обнаружено, что внеклеточные цис-полиненасыщенные (арахидоновая, Сю,. докозатриеновая, Сз,', линолевая, С~зэ), цис-мононенасыщенные (слеиновая, С,„,) и насыщенные (миристиновая, Смс ) ЖК в концентрации 10-50 мкМ вызывают доза-зависимое уменьшение пиковой амплитуды и ускорение кинетики активации и инактивации К -токов в широкой области лгембранных потенциалов.

Эффект ЖК обратим при добавлении в наружную среду 0,1'/ь альбумина (который имеет связывающие участки для ЖК). Выявлена корреляция между числом двойных связей в молекуле кислоты (степенью ненасыщенности) и ее эффекгнвностью. Наиболее ~ффективными модуляторами активности К- каналов оказались оолиненасыщенные ЖК: АК, докозатриеновая, линолевая 1!редварительная инкубапия макрофагов с ингибиторам циклооксигеназ индометацином (10 мкМ) или ингибитором липоксигеназ нордигидрогуаретиковой кислотой (10 мкМ) не предотвращает эффект арахндоновой и докозатриеновой кислот (Крутецкая и др., 1995а, 1995б; Кгц!егз(гауа ег а!., 1994; Крутецкая, Лебедев, 1998). Ингибитор фосфолипазы Аз и освобождения ЖК 4-бромфенацилбромид (10-50 мкМ), наоборот, вызывает дозо-зависимое увеличение амплитуды К -токов при всех значениях мембранного потенциала (Крутецкая и др., 1994; Кгв!ага<саун ег а!., 1994).

Наиболее выраженным эффектом АК н других ЖК на К'-каналы в перитонеальных макрофагах и других объектах является существенное ускорение кинетики инактивации токов. Одним из возможных механизмов ускорения спада токов при действии различных агентов является предпочтительное блокирование открытых каналов. Такой механизм ускорения кинетики инактивации потенциал-зависимых К- токов под действием четвертичных ионов аммония был предложен а классических работах Армстронга (см. Н)!!е, 1992, 2001) на мембране гигантского аксона кальмара.

Другим вероятным лгеханизмом ускорения спада токов может быть специфическое влияние агентов на инактивационную фазу К -токов (Конка(ге-Е>пЬо(з е! а!., 1991). Полученные данные позволяют предположить прямое влияние АК и других ЖК на К'-каналы в мембране перитонеальных макрофагов крысы. 4.4. Тирозинкииазы н тирозинфосфатазы Несмотря на то, что фосфорилнрованне белков по остаткам тирозина является более редким событием по сравнению с фосфорилированием по остаткам серина нли трсоиииа, установлено, что фосфорилирование по тирознну играет ключевую роль во многих клеточных процессах, таких как пролнферация, рост и днфференцировка (О!еппеу, ! 992; ЯсЫезз(пйег, И!псЬ, 1992).

Процессы фосфорилирования/дефосфорилирования остатков тирознна являются общим элементом путей внутриклеточной сигнализации, запускаелгых различными агентами, такими как ростовые факторы (ЯсЫеэв(пйег, П!г!сЬ, 1992), цитокины (СЬ(Ьа с! а1,, 1993; !Ые, 199б), нейротрансмнтгеры (Ваг)(пй, Огеепбег8, !99!). Можно выделить 2 типа тирозинкиназ и тирозинфосфатаз: рецепторные и цитоплазматические (Г(зсЬег ег а!.,1991; Нопгег, 1995, 199б; Топ1сз, Нее(, 1996).

Репепторные тирозннкиназы связаны с рецепторами ростовых факторов (эпндермального фактора роста, инсулииоподобного фактора роста, фактора роста тромбоцитов и др. !Седела, Ой!, 1992; О!!г(сЬ, бсЫеэз(пбег, 1990). Наиболее изученными цнтоплазматическими тирозинкцнаюмн являются тирозинкиназы семейства Ягс, являющиеся продуктами онкогена вируса саркомы Рауса (Егре1, Соцппе!6йе, !995; Борец)-рогйа, )995; Корен(-рогяа, Сооппе!бяе, 1995). 4.4.1. Рецепторы с тирозинкннаэной активностью Фосфорилирование белков по остаткам тирозина сосщвляет менее 0,01 % от общих процессов фосфорилирования в клетке. Фосфорилирование тнрозина происходит практически исключительно у многоклеточных и отсутствует у одноклеточных эукариот. Таким образом, фасфорилирование тирозина может рассмагриваться как показатель передачи сигналов у многоклеточных организмов (1)!!г!сй, 5сй)еэяояег, 1990).

Рецепторные тирозинкиназы участвуют в трансмембранной передаче сигналов, в то время как внугриклеточные тирозинкиназы принимают участие в процессах сигнализации в клетке, включая передачу информации в ядро. Общая характеристика рецептпрных тирозинкиназ. Тирозинкиназные рецепторы, играющие ведущую роль в процессах роста, развития и дифференцировки клеток, имеют общий план строения и состоят из четырех основных доменов (Садепа, Ой!, 1992; Нцпгег, 1996). Экстраклеточный домен участвует в связывании лиганда и получении внешнего сигнала.