ВКР: Создание корреляционного флуоресцентного спектрометра и отработка методик для исследования сложных молекулярных систем

ВВЕДЕНИЕ
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС) — современная экспериментальная методика, позволяющая изучать и эффективно анализировать динамические свойства молекул, макромолекул и наночастиц в различных средах. В отличие от традиционных методов флуоресцентной спектроскопии, ФКС в общем случае исследует не спектральное распределение интенсивности излучения, а флуктуации интенсивности излучения, регистрируемого от небольшого числа интенсивно светящихся люминофоров, находящихся в равновесных диффузных системах. Главные причины таких флуктуаций — диффузия флуоресцирующих объектов через исследуемый объем, либо изменение детектируемого сигнала во времени вследствие протекания химических реакций [1]. Метод ФКС позволяет осуществлять количественный анализ таких флуктуаций с помощью вычисления автокорреляционной функции вида:
где за F(t) принимается интенсивность регистрируемого излучения, τ — временной промежуток, разделяющий два измеренных сигнала. Строгое описание метода впервые было дано Д.Магде, Л. Элсоном и В.В. Веббом в 1972г. [2]. Позднее ими же был предложен способ практической реализации, эффективность которого подтвердили эксперименты по наблюдению за флуктуациями химического равновесия в реакциях связывания бромистого этидия с двухцепочечной молекулой ДНК. Так же предсказаны широкие перспективы метода для исследования релаксационных процессов [3]. В последующие годы было опубликовано немалое количество работ, посвященных определению концентраций,
коэффициентов трансляционной и вращательной диффузии различных молекул [4]. Эти ранние исследования страдали, главным образом, от невысокого отношения сигнал-шум, вызванного большим числом детектируемых молекул, значительным уровнем фоновой засветки, недостаточной чувствительностью используемых детекторов. Настоящий же расцвет метода ФКС наступил в начале 1990-х годов, когда была предложена и осуществлена идея о применении конфокального микроскопа для детектирования одиночных молекул [5,6]. На протяжении последних 20 лет ФКС активно используется для исследования процессов поступательной и вращательной диффузии одиночных молекул в растворах и коллоидах, определения их размеров, концентраций, молекулярных масс, констант химических реакций, а так же для изучения межмолекулярных взаимодействий и процессов образования молекулярных агрегатов [4]. На сегодняшний день, флуоресцентная корреляционная спектроскопия находит свое обширное применение в биофизике, где наряду с исследованиями флуоресцирующих объектов (например, зеленый флуоресцентный белок [7]), активно применяются одиночные люминофоры, используемые в качестве флуоресцентных маркеров и позволяющие с высокой точностью определять положение в пространстве и перемещение биологических объектов. Детектирование антител, наблюдение за процессами, сопровождающими проникновение вирусов в живые клетки, исследование процессов, происходящих в ядрах и мембранах живых клеток, изучение флуктуаций в конформации белков — решение этих задач активно задействует методы ФКС. Помимо всего вышеперечисленного, ФКС применяется и для исследования фотодинамических свойств самих люминофоров, например кинетики триплетных состояний в органических красителях и флуоресцентных белках, явления антигруппировки фотонов, процессов фототушения люминесценции [8].