ВКР: Флуоресцентный анализ в исследовании денатурации сывороточного альбумина человека под действием ионных детергентов

Введение
Данная дипломная работа посвящена применению методов флуоресцентного анализа для исследования конформационных перестроек сывороточного альбумина человека под действием ионных детергентов. Сывороточный альбумин (66,4 кДа) представляет собой глобулярный белок плазмы крови человека [1]. Уникальная способность молекулы сывороточного альбумина человека связывать обширный круг органических и неорганических лигандов определяет одну из основных функций этого белка – транспорт физиологических метаболитов. Исследование денатурации этого белка чрезвычайно важно в связи с его физиологическими функциями в крови, т.к. позволяет делать выводы об уровне сохранения нативной конформации белка и, следовательно, об уровне сохранности его физиологических свойств в различных условиях. Это обуславливает актуальность работы. Основой взаимодействий молекулы сывороточного альбумина человека с лигандами является структурная подвижность этой белковой молекулы, обеспеченная уникальной петлевой укладкой единственной полипептидной цепи белка из 585 аминокислотных остатков. Вторичная структура сывороточного альбумина человека, стабилизируемая водородными связями между пептидными группами аминокислотной цепи, состоит из -спиральных участков и участков хаотической укладки. Около 50 – 67 % аминокислотных остатков уложены в -спирали при физиологическом значении pH (7,4). В настоящее время принята доменная модель структуры альбумина, согласно которой молекула сывороточного альбумина человека состоит из 3 практически одинаковых доменов. Каждый из доменов содержит 10 - спиралей, обозначаемых h1 – h10. Соседние домены I-II и II-III связаны между собой двумя большими -спиралями, которые являются соединенными между собой вытянутыми N- и C- концевыми участками каждого из двух доменов – спирали h10(I) – h1(II) и h10(II) – h1(III) соответственно. Таким образом, общее число -спиральных структур в молекуле сывороточного альбумина человека составляет 28. На сегодняшний день утвердилась модель «сердца» третичной структуры сывороточного альбумина человека, домены в этой модели расположены под углом друг к другу. Стабильность третичной структуры зависит не только от системы нековалентных взаимодействий внутри белковой глобулы, но и дополнительно стабилизируется ковалентными дисульфидными связями, сохраняющимися в денатурированном белке. Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной структуры белка, т.е. нарушение, разупорядочивание системы нековалентных взаимодействий, не затрагивающее его ковалентной структуры [1]. Денатурация, как правило, сопровождается утратой белком функциональных свойств, что обуславливает интерес к изучению механизмов белковой денатурации. Эффективными денатурирующими агентами являются ионные детергенты, среди которых в биохимической практике особенно часто используют анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) и катионный детергент цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ, цетавлон) [2].
Целью данной работы является исследование механизма денатурации молекул сывороточного альбумина человека под действием ионных детергентов. Для реализации цели были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать действие различных концентраций анионного детергента ДСН и катионного детергента ЦТАБ на сывороточный альбумин человека при различных значениях рН методами флуоресцентного анализа по изучению неполяризованной собственной белковой триптофановой флуоресценции. 2. Исследовать действие различных концентраций анионного детергента ДСН и катионного детергента ЦТАБ на сывороточный альбумин человека при различных значениях рН методами флуоресцентного анализа по изучению поляризованной собственной белковой триптофановой флуоресценции. Исследование собственной флуоресценции белков, обусловленной свечением триптофана, широко применяется в настоящее время для оценки конформационного состояния молекул белка. По изменению спектральных характеристик флуоресценции триптофана альбумина можно судить о конформационном состоянии глобул альбумина в растворах с денатурирующими агентами (ДСН, ЦТАБ).
Глава 1. Применение флуоресцентной спектроскопии в исследованиях структуры и свойств молекул белков
§1.1. Физические основы флуоресцентной спектроскопии
Полную энергию Е молекулярной системы можно представить в виде суммы электронной Еэ , колебательной Ек и вращательной Ев составляющих: Е = Еэ + Ек + Ев; Еэ>>Ек>>Ев . Переходы между энергетическими состояниями сопровождаются поглощением или испусканием излучения, частота которого определяется ν = (Еn - Еm)/h = ∆Еэ /h + ∆Ек/h + ∆Ев /h. Люминесценция – широко распространенный в природе вид излучения [3]. Она возникает в результате поглощения веществом энергии возбуждения и перехода его частиц из основного в возбужденное состояние. Таким образом, люминесценция – свечение вещества, возникающее в результате электронного перехода в этих частицах при их возвращении из возбужденного в основное состояние (рис. 1.1.). Если возбуждение происходило за счет поглощения электромагнитного излучения в оптической области, то испускание носит название фотолюминесценции. Широкая возможность переходов между всей совокупностью электронно-колебательно-вращательных уровней и обуславливает возникновение сложных полосатых (полосато-линейчатых) или сплошных молекулярных спектров поглощения и люминесценции.