Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 80
Текст из файла (страница 80)
В свете этих данных особое значение получают результаты изучения мутаций промотора, суммированные ранее на рис. 115. За связывание специфических последовательностей ДНК с белком может быть ответственно незначительное число существенных специфических контактов в пределах большей по размеру области. Распределение сайгон мутаций показывает, что левая часть оператора проявляет более высокую чувствительность к повреждениям: она несет шесть мутаций по сравнению с двумя в правой части.
Две мутации в правой части являются строго симметричными копиями мутаций, Рис. 14.7. хлс-оператор имеет симметричную последовательность нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов пронумерована относительна стартовой точки транскрипции, обозначенной е 1. Области двойной симметрии показаны затемненными блоками. Ось симметрии проходит через пару оснований в положении е 11. Замены, ведущие к конститутивному выражению генон, показаны парами оснований, распаложеннымн над нуклеотилиой последовательностью.
Тимпнавые основания, находящиеся обнаруженных в левой части. (В положении ф!7 Т вЂ” А замешает С вЂ” Ст, тогда как в положении + 5 А —.Т замешает Π— С. Подобным же образом в положении + 14 С вЂ” О замещает Т вЂ” А, а в положении 98 Π— С замешает А — Т.) Однако эффект конститутивных мутаций не одинаков для членов каждой пары. Таким образом, симметрия имеет отношение к контактам репрессора с оператором, но тем не менее репрессор более тесно связывается с левой частью оператора. Участки усиления и зашиты оснований проявляют некоторую симметрию в пределах основной области тесных контактов.
На рис. 14.7 показано, что все (кроме двух) тиминовые остатки в области от + 1 до + 22 могут быть перекрестно связаны с репрессором. Эксперименты с метилированием показывают, что большая часть пуринов (А и О) между положениями + 3 и + 19 весьма эффективно защищена благодаря связыванию с репрессором.
Немногие пурины проявляют повышенную чувствительность, по-видимому, в результате образования «гн- в положениях, гле замещение бромурацила леласт возможным установление перекрестных связей с репрессорам, показаны кружками. Стрелки, илущне в направлении последовательности, указывают пуринавые основания, защищаемые репрессарам от метилиравания.
Стрелки, идущие от последоватедьиости, указывают положения, в которых ыетилирование иовыщено. Длина стрелок соответствует силе эффекта Область сильных контактов лежит между основаниями -1- 1 н е зз. Вне этой области осуществляются бо.тес слабые кантактъг, 184 Часть 1Ч. Контроль генной экспрессии у прокариот дрофобных карманов» в комплексе репрессор — оператор. Контакты между основаниями + 1 и + 6 являются по существу симметричными в отношении контактов, образуемых между основаниями + 21 и + !6; контакты, возникающие ближе к оси симметрии, не симметричны. Таким образом, контакты репрессора с оператором симметричны на концах области связывания; в участке непосредственно вокруг оси симметрии такая симметрия контактов нарушена Центральная область, имеющая критическое значение для связывания репрессора, занимает, согласно грубой оценке, первые 20 пар оснований, расположенных по ходу транскрипции от ее стартовой точки.
Следует напомнить, однако, что точки контактов РНК-полнмеразы в промоторе лежат, как показано на рнс. 1!.5, вблизи стартовой точки против хода транскрипции. Следовательно, основные области контактов для двух белков являются смежными, а не перекрывающимися. Причина их взаимного исключения может быть обусловлена необходимостью вытягивания каждого белка вдоль ДНК, что и предполагалось на основании способности репрессора зашишать ДНК вплоть до положения — 5 от расшепления нуклеазой; возможно также, что присутствие репрессора может создавать достаточные стерические помехи, препятствующие стабилизации РНК-полимеразы на промоторе. Взаимодействие субъединип реп рессора Белок-репрессор имеет два типа связываюших сайтов, которые (как мы уже видели) взаимодействуют, обеспечивая его способность контролировать выражение генов в ответ на условия окружающей среды.
Репрессор непосредственно узнает специфическую нуклеотидную последовательность оператора. Он связывается также с малой молекулой индуктора и вследствие этого теряет способность связываться с операторной ДНК. В субъединице репрессора могут быть идентифицированы два типа участков связывания. Для идентификации используют мутации в гене 1«с!, которые инактивируют репрессор. Их возможная взаимосвязь Й чьчо зависит от мультимерной структуры репрессора. Мономерные субъединнцы репрессора соединяются в клетке случайно, образуя активный тетрамерный белок.
В тех случаях, когда в клетке имеется два разных аллеля гена )ас1, субъединицы двух типов могут ассоциировать с образованием гетеротетрамера, который по своим свойствам может отличаться от гомотетрамера. Такой тип взаимоотношений, называемый межаллельной комплементацией (гл. !), является характерным свойством мульти- мерных белков. В случае некоторых мутантных репрессоров имеет место определенный тнп взаимодействия, названный негативной комплемеитацией. Она может наблюдаться при комбинировании генов 1ас! и 1ас1+. Мутация (ас! ~ ведет к образованию репрессора, который не способен связываться с оператором и является поэтому представителем аллелей конститутивного типа. Поскольку мутация типа 1ас! ннактивирует репрессор, она является рецессивной по отношению к дикому типу.
Однако символ — 4 указывает, что этот вариант негативного типа проявляет доминантность в случае объединения с аллелем дикого типа. Доминирование обусловлено тем, что аллель !ас! -а кодирует испорченную субъединицу, которая не только сама по себе не способна связаться с оператором, но, являясь частью тетрамера, препятствует также связыванию с ним любой полноценной субъединнцы. Из этого следует, что для достижения репрессии необходим действительно репрессор-тетрамер„а не отдельный мономер. Повреждаюшее действие может быть также достигнуто ш И!го при смешивании соответствующих полноценных и испорченных субьединиц. С помощью мутаций (ас! был идентифицирован сайт связывания с ДНК в субъединице репрессора. Этот факт объясняет способность мутаций препятствовать связыванию смешанных тетрамеров с оператором; уменьшение числа связывающих сайтов должно довольно значительно уменьшать специфическое сродство репрессора к оператору. На рис. 14.8 представлена карта гена lас),на которой показано, что все мутации )ас! сгруппированы в крайнем левом конце гена.
Это прямо указывает на то, что в Х-концевой области белка находится участок связывания Д1!К. Рецессивные мутации типа (ас! локализуются и в других участках молекулы, но, по-видимому, действуют на связывание белка с ДНК косвенным путем. Роль Х-концевой области в специфическом связывании репрессора с ДНК подтверждается также локализацией в соответствующей части молекулы ДНК мутаций «прочного связывания». Такие мутации повышают сродство репрессора к оператору, причем иногда в такой степени, что он не может отделяться от него даже в присутствии индуктора. Это редкий тип мутаций. Неиндуцибельные мутации типа (ос!' делают репрессор нечувствительным к индуктору.
Такой эффект может быть обусловлен либо утратой белком участка связывания с индуктором,либо появлением неспособности перелавать свой сигнал участку связывания с ДНК. К мутациям этого класса относятся те, которые обусловливают неспособность субъединиц репрессора агрегировать с образованием тетрамера. На рис.
14.8 можно видеть, что мутации Ьс!' встречаются группами в участках, которые довольно равномерно распределены по длине гена. Промежутки могут соответствовать изгибам в полипептцдной цепи. (Систематическое изучение эффектов аминокислотных замен показало, что примерно 6;„' положений являются нейтральными, не оказывающими влияния на репрессию.) Репрессор — белок, связывающийся с ДНК Поведение выделенного белка-репрессора (п чйго прямо показывает, что в нем имеется участок связывания с ДНК, способность которого оставаться присоединенным к ДНК оператора зависит от структуры остальной части молекулы.
Под действием трипсина репрессор разрезается преимущественно по положению 59. С-концевой фрагмент белка, содержащий аминокислотные остатки 60 — 360, называют «ядром», резистентным к трипсииу. Он сохраняет способность собираться в тетрамер и связываться с индуктором; однако он не обладает способностью присоединяться к оператору. Х-концевой фрагмент, содержащий аминокислотные остатки 1-59, называют длинным Х-концевым фрагментом.
Он в свою очередь может быть 185 14. Оперон на примере организации лактозных генов 0 25 60 75 100 126 150 176 200 225 250 275 500 526 360 Отделение ренрессора от ДНК Рис. !4.8. Мутациоиный анализ гена !ас! идентифицирует обла- сти, ответственные за выполнение различных функций, Протяженность гена пронумерована числам колонов. На верхней карте показано распределение мутации !ас! по всей длине гена и наличие му- таций !ас! только в Ы-концевом участке. Мутации !асу, нарушающие расщеплен трипсином по 51-му аминокислотному остатку с образованием фрагмента из амннокислотных остатков 1 — 51, названного коротким )ч(-концевым фрагментом.
Как короткий, так и длинный )ч)-концевые фрагменты сохраняют способность присоединяться к ДНК, причем нх контакт с операторным участком ДНК не отличается от контакта неповрежденного репрессора (хотя они связываются менее прочно по сравнению с ннтактным белком). Способность )х(-концевых фрагментов присоединяться к оператору показывает, что их структура рег пе не зависит от остальной части белка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
