Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 79
Текст из файла (страница 79)
(Способность к комплементации характерна только для генов, выражение которых связано с образованием диффундирующнх продуктов.) Это значит, что в тех случаях, когда два г(ис-активных сайта расположены вблизи друг от друга — например, промотор 14. Оперои иа примере организации лактозных генов Рис.
14.4. Конститутивные мутации оператора (о') являются Чнс-доминантными. Верхний оперон содержит мутантный оператор, не спооэбный связываться с репрессором. Поэтому прилегаюгцие к нему структурные гены выражаются конститутивно. Нижний оперон содержит оператор дикого тнпж способный связываться с репрессором и поэтому выражаемый только при индукции.
Поведение каждого ряда структурных генов контролируется исключительно смежным оператором. Другой оператор не влияет иа их свойства. и оператор,— мы не можем классифицировать мутации с помощью комплементационного теста. Мы можем различить их только по их влиянию на фенотип. Наконец, следует указать, что гуно-доминантность характерна для любого сайта, физически связанного с контролируемой последовательностью. Так, если контролирующий сайт функционирует как часть полицистронной мРНК, мутации в нем будут проявлять точно такой эюе тил г)ис-доминантности, который они проявляли бы, если бы он функционировал в ДНК.
Критическое значение имеет тот факт, что контролирующий сайт невозможно отделить физически от генов. С генетической точки зрения не имеет значения, находятся ли сайт и гены вместе в ДНК или в РНК. В промоторе или гене репрессора могут встречаться неиндуцибельные мутации Неиндуцибельные мутантные опероны не могут вообще выражаться. Они относятся к тем же двум генетическим классам, что и конститутивные мутанты. Для определения природы мутации могут быть использованы те же приемы изучения взаимоотношений с целью определения доминирования для каждого типа мутаций. Промоторные мутации, как мы уже указывали, являются г)ис-активными. Те мутации, которые предотвращают связывание РНК-полимеразы с локусом 1асР, превращают оперон в нефункционирующий из-за того, что он не может быть транскрибирован.
Мутации в гене 1ас1, влияющие на способность репрессора связываться с индуктором, вызывают тот же фенотип. Репрессор сохраняется в активной форме, которая способна узнавать оператор и предотвращать транскрипцию. Добавление индуктора оказывается бесполезным. Такие мутации описаны как 1ас1'. На рне. 145 показано, что они проявляют транс-активность и доминируют няд диким типом.
Это обусловлено тем, что мутантный репрессор связывается со всеми операторами в клетке, препятствуя их транскрипции, и не может быть отделен от них независимо от свойств любого другого белка-репрессора, который может присутствовать в клетке. Каким путем репрессор блокирует транскрипцию? Впервые репрессор был получен при выделении из экстрактов клеток Е, сой компонента, способного связываться с «добровольным» индуктором ИПТГ. (Поскольку количество репрессора в клетке слишком незначительно, для получения достаточного количества материала необходимо было использовать мутацию промотора, повышающую эффективность транскрипции гена 1ас1, и ввести такой мутантный покус 1ас! в молекулу ДНК, присутствующую в клетке в большом числе копий. В результате удалось увеличить общую продукцию репрессора в 100-1000 раз.) Связывание очищенного белка-репрессора с ДНК впервые было охарактеризовано с помощью метода связывания на фильтрах.
Применение этого метода обусловлено способностью нитроцеллюлозных фильтров удерживать белок, но не ДНК. Однако ДНК, комплексирующаяся с белком, также задерживается на фильтре. В результате специфически отбираются последовательности ДНК, способные связываться с репрессором. Репрессор связывается с ДНК, содержащей последовательность )ас-оператора дикого типа, при этом ДНК должна иметь двухцепочечную форму. Связывания репрессора не происходит, если ДНК выделена из мутанта о'.
При добавлении ИПТГ репрессор отделяется от 182 Часть 1У. Контроль генной экспрессии у прокариот гаг ! ьдебтбодомдьзздедоптгэбт лю, ~у~ЯЦьдттзикеьэухтхт!ебебтздьэр,'бтболздьэлздзухздоуедсть уьзл СЭ вЂ” — — —.Ф ' -'й' м ! С"") с '1.ь;. з 'Ф ебебедьбОяб дьмедеп ! ггь охарактеризовано с точки зрения как последовательности ДНК, так и структуры белка. Оператору присугцс свойство, общее для многих сайтов узнавания белками: он имеет ось двойной симметрии. Инвертированные повторы не совсем идентичны. Как видно на рис. 14.7,между ними имеется три отличия. (Явное исключение составляет отсутствие симметрии у промотора, который должен содержать информацию о направлении транскрипции.) Какую роль играет симметрия в узнавании оператора? Возможность перестроек ДНК с образованием структуры креста была исключена. Присоединение репрессора к ДНК ведет к изменению в структуре дуплекса, эквивалентному незначительному расплетанию (но не настолько, чтобы образовались свободные пары оснований или структура креста), Отражает ли симметрия в последовательности ДНК наличие симметрии в белке? Такая возможность не исключается, поскольку репрессор †э тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц, каждая из которых, следовательно, должна иметь один и тот же участок связывания с ДНК.
Для определения точек, с которыми репрессор контактирует в операторе, используются те же подходы, которые мы уже обсуждали в случае взимоотношений полимеразы и промотора (гл. ! 1). Конститутивные точковые мутации дают возможность идентифицировать отдельные пары оснований, имеющие критическое значение; делеции материала с любой стороны позволяют определить концевые точки области связывания.
Были проведены эксперименты, в которых связанную и не связанную с репрессором ДНК сравнивали по чувствительности к метилированию или образованию поперечных сшивок в ДНК под действием Угн-облучения. Пель этих экспериментов — идентификация оснований, которые либо защищены, либо более чувствительны к обработкам, когла они связаны с белком. В тех случаях, когда связанную с репрессором ДНК выделяли посредством деградации незащищенных последовательностей нуклеазой, она не соответствовала по протяженности всей области симметрии.
Ранее уже указывалось, что зта область представлена 26 парами ос- Контакты в операторе !або-ДНК )п пйго. Таким образом, реакция между белком-репрессором и 1асо-ДНК зп И!го контролируется так же, как и зп у!во и, следовательно, может быть использована для изучения механизма репрессии.
Какова точная локализация оператора по отношению к промотору? Определение размеров 1асо-локуса по длине ДНК, защищаемой репрессором зп И!го от действия нуклеаз, показало, что он представляет собой область размером около 26 пар нуклеотидов. Она простирается от положения — 5 сразу же слева от стартовой точки мРНК до положения -1-21 в пределах транскрипционной единицы.
Следовательно, область оператора может перекрываться с концом промотора, начинающимся от блока Прибнова и кончающимся в пределах транскрипционной единицы. Препятствует ли такое перекрывание одновременному связыванию репрессора и РНК-полимеразы с 1ас-ДНК? Эксперименты по выяснению конкурентных взаимоотношений белков показали, что присоединение любого из двух белков к ДНК предотвращает связывание другого.
Такая ситуация изображена на рис. 14.6. Подобные же результаты были получены для нескольких других оперонов. Следовательно, в основе обычного механизма репрессии лежит связывание репрессора с оператором, перекрывающего, по крайней мере частично, последовательность, хоторая должна узнаваться РНК-полимеразой. Перекрывание не всегда происходит в одной и той же области промотора. Например, у фага лямбда оператор лежит в области, расположенной слева от промотора (гл. 16).
Однако общий принцип сводится к тому, что связывание репрессора с оператором мешает РНК-полимеразе подойти к своему промотору, что препятствует инициированию транскрипции. Каким образом репрессор узнает специфическую последовательность ДНК оператора? Взаимодействие между лактозным репрессором и оператором часто используется как образец реакции связывания белка со специфической последовательностью ДНК. Оно наиболее хорошо Рис.
!4.5. Неиндуцибельиые мутации !ас1 являются доминантными. Ген !адн прояупирует репреееор. ко~орый не монет связываться е инпуктором, нвпрнмер из-зя потери евйтв связывания е ннм. В результате репреесор остается постоянно евязвиным е опервтором независимо от присутствия иияукторя. Такой геи является траяс-яоминвнтным, твк «як введение гена !ас! ' не приводит к изменению эффекта: иеиидупибеяьный репрееоор остается связанным с оператором. 183 14.
Оперон на примере организации лактозных генов l 1 l / г I 'ласслеумельугхл~~~у еххсеоОахэжяхаеаелссе ! 1 ! аэ .",.бк".хел '~елбввуерайкзлл хлхлатмелевепеспуьюаме К 1лтцттдет т Асддт и А 1тт,.~ ~ д~ т от ЙЬЙЙС пйй СМ в и А т А А с А А('т.Отт'.) с А с А' с А -!о +1 +!о А с А А с А с А с сОтСт) А А с А с Ото и спкСт!йй(тф)(зй А '11 ", 1 Е:ф 1 мвнк 1 Оех «еммеган» Рис.
14.6. Связывание репрессора и связыва- ние РНК-полимеразы -взаимоисключающие события в аператорно-промоторной области !пс-оперопа. нований, расположенными между нуклеотидами в положениях — 5 и +21. Зона, идентифицируемая конститутивными мутациями, имеет еше меньший размер. В пределах центральной области, представленной 13 парами оснований и расположенной между нуклеотидами + 5 и + 17, содержится восемь сайгон, в которых, как было установлено, замещение одной пары оснований приводит к конститутивности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
