Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 81
Текст из файла (страница 81)
Этот вывод согласуется с моделями, в которых участок связывания с ДНК представлен как ответвление или выступ, образуемый 50 аминокислотами )ч(-концевого фрагмента на основной части белка. Ответвление может быть соединено с «ядром» белка областью, напоминающей шарнир, которая образована аминокислотными остатками в положениях 50 — 80. Остальная часть белка, представленная аминокислотами 81 †3, ответственна за сборку в тетрамерную структуру и связывание с нндуктором. Если )ь(-концевой участок является ответвлением, способным связываться с ДНК, какова функция тетрамерной структуры и как она контактирует с ДНК? Согласно одной из моделей, предполагается, что репрессор имеет форму удлиненной гантели или цилиндра длиной примерно 1!5А, ось которой может пересекаться с осью ДНК, образуя небольшой угол, равный 15 — 20'.
Ядра всех четырех субъединиц контактируют своими центральными областями; Х-концевые участки связывания находятся по краям молекулы, располагаясь парами. Не исключено, что на самом деле только две из четырех субъединиц контактируют с ДНК, оставляя два других участка связывания с ДНК незанятыми. Хотя «ядро» субъединицы не узнает операторного участка, оно все же способно связываться с ДНК неспецифически, так что, по-видимому, оно также осуществляет контакты (хотя они не являются настолько выраженными, чтобы оказывать влияние на характер защиты ДНК в той же мере, как это делает один ?з)-концевой фрагмент).
Таким образом, согласно этой модели, комплекс ре- прессор — ДНК представляет собой тетрамерный белок, симметрично расположенный на ДНК, причем только незначительная часть полипептидной цепи (примерно 20%) тесно связана с ДНК. Такое представление принято и другой, совсем отличной моделью, которая предпола- образование тетрамеров пз мономеров, обозначеаы красным цветом.
Нижняя карта показывает, что мутации !аср не встречаются в области, прелшествуюшей остатку 62, н группируются мюклу положениями 150 и 300, причем группы обычно отделены друг от друга 26 кодонами илн близкими к атому расстояниями. гает перпендикулярное расположение оси репрессора по отношению к оси ДНК, в результате чего только два )ч(- концевых участка в одном из концов репрессора связаны с оператором.
Тетрамер репрессора прочно связывается с оператором. Индуктор вступает в действие, связываясь с репрессором. Каким образом происходит отделение белка от ДНК? Различные индукторы вызывают характерное уменьшение сродства репрессора к оператору ш И!го. Эти изменения коррелируют с эффективностью индукторов ш узуо. Следовательно, механизм индукции основан на уменьшении взаимопритяжения между репрессором н оператором. Чем это обусловлено? Скорость, с которой происходит отделение репрессора от оператора, довольно низкая.
В типичном случае полу- период распада комплекса колеблется в пределах от !О до Л)мин в зависимости от конкретных условий. Однако при добавлении ИПТГ стабильность комплекса немедленно уменьшается, что проявляется в резком укорачивании полупериола его распада. Этот результат может способствовать выбору между двумя моделями, изображенными на рис. 14.9. Модель равновесия (изображенная слева)предполагает, что репрессор, связанный с ДНК, находится в равновесии со свободным репрессором. Индуктор связываешься со свободной формой репрессора, вызывая нарушение равновесия путем предотвращения его повторного связывания с ДНК. Однако скорость диссоциацни репрессора и оператора (как показали изменения в отсутствие индуктора) оказалась эначнглельно ниже той, которая постулируется данной моделью.
Это значит, что индуктор должен связываться нелосредстипенно с белкомрепрессором, находящимся в комплексе с оператором. Как следует из модели, представленной справа на рис. 14.9, присоединение индуктора должно вызывать изменение в свойствах репрессора, обусловливающее его отделение от оператора. Связывание комплекса репрессор — ИПТГ с оператором может быть изучено использованием больших концентраций белка при метилировании с определением эффектов зашиты/усиления. Большое количество белка 186 Часть 1Ч. Контроль генной экспрессии у прокариот Рис.
!4хк Происходит ли присоединение инкуктора к свободному релрессору с нарушением состояния равновесия 1локазаио слева) или непосредственно к релрессору, связанному с оператором !показало справа)? компенсирует низкое сродство комплекса репрессор- ИПТГ к оператору. Комплекс осуществляет такие же контакты с ДНК, которые характерны и для свободного репрессора или Х-концевого фрагмента репрессора. Аналогичный результат получен с мутантными репрессорами, сродство которых к операторному участку ДНК повышено; они устанавливают тот же тип контактов.
В целом типы репрессора, у которых различия в сродстве к оператору достигают семи порядков величины, устанавливают одни и те же контакты с ДНК. Изменения в сродстве репрессора к ДНК должны поэтому происходить путем влияния на общую конформацию Х- концевого участка, связанного с ДНК, а не путем создания или разрыва одной или нескольких отдельных связей. В результате изменения конформации всей области, связанной с ДНК, многие или все связи с ДНК должны одновременно стать ослабленными. Как это происходит? На основе данных, полученных с помощью разных методов, полагают, что присоединение индуктора вызывает немедленное конформационное изменение белка-репрессора.
Присоединение двух молекул индуктора к репрессору-тетрамеру достаточно для снятия репрессии. Однако мы тюка не знаем, каким образом общее конформапионное изменение влияет на сродство репрессора к оператоРу. Наиболее вероятно, что конформационное изменение передается от «ядра» через шарнир в Х-концевой участок. На рис. 14.10 представлена такая модель. Конформация участка связывания с ДНК изменяется от состояния, в котором он точно соответствует последовательности ДНК, до состояния, когда Х-концевой участок не способен достаточно тесно контактировать с ДНК. НаКОПЛЕНИЕ ИЗЛИШКОВ РЕПРЕССОРВ Вероятно, все белки, проявляющие большую специфичность в отношении определенной последовательности, проявляют низкое сродство в отношении каких-то случайных последовательностей ДНК.
Большое число участков, отличающихся низким сродством, будут конкурировать с небольшим числом участков с высоким сродством за связывание с репрессором-тетрамером. В геноме Е. сой существует только один сайт, обладающий высоким сродством к репрессору,— оператор. Остальная ДНК может рассматриваться как источник связывающих сайтов с низким сродством к репрессору.
Каким образом происходит распределение молекул репрессора между сайтами? Что происходит с репрессором после присоединения к нему индуктора и отделения его от оператора? Чтобы из всей последовательности генома выбрать последовательность оператора, специфическое сродство связывания у репрессора должно во много раз превышать степень его случайного сродства. Действительно, репрессор присоединяется к операторному участку ДНК в 4.10« раз лучше, чем к любой другой случайной последовательности нуклеотидов той же протяженности, (Эта величина представляет соотношение констант ассоциации репрессора с !асО-ДНК и друп<ми ДНК.) Согласно имеющимся данным, оператор представлен 26 парами нуклеотидов в геноме из 4,2.!Ов пар нуклеотидов, так что избыток неоператорной ДНК над операторной составляет 2.10з пар оснований.
Иными словами, существует 2.10< сайгон связывания с низким сродством к репрессору по сравнению с одним сайтом высокого сродства. Относительная предпочтительность репрессора в отношении операторного участка ДНК в пределах баки<грааль«ого генома определяется отношением величины, выражающей предпочтительность рег зе в отношении сайта с высоким сродством (4 10«), к числу сайтов с низким сродством (2 1Оз). Результат определения показывает, что репрессор связывается с оператором примерно в 20 раз лучше, чем с любым другим сайтом.
В свете этих данных становится понятно, почему мутации, уменьшающие сродство оператора к репрессору в 20 — 30 раз, приводят к конститутивному выражению генов оперона. В пределах генома мутантные сайты могут утратить преимущество в отношении случайных сайтов. Их специфическое сродство к репрессору по сравнению со случайными сайками оказывается не настолько выраженным, чтобы они могли сохранять свой статус предпочтительных нуклеотидных последовательностей.
В результате таких взаимоотношений в неинлуцированных клетках одна молекула репрессора-тетрамера присоединяется к оператору. Все или почти все оставшиеся тетрамеры будут присоединяться случайно к другим участкам ДНК, как показано на рис. 14.11. Свободные тетрамеры репрессора, по-видимому, либо не содержатся в клетке, либо их очень мало. Присоединение индуктора к репрессору приводит почти к тысячекратному уменьшению сродства репрессора к оператору. Сродство же в отношении обычных последовательностей остается неизменным. В резуль~ате в индуцированной клетке все или почти все тетрамеры репрессора будут «сохраняться» в случайных сайтах ДНК. Следовательно, эффект индукции ведет не к появлению свободных молекул репрессора, а к изменению его распределения по ДНК.
Исходя из способности репрессора сохраняться на ДНК, можно сделать ряд выводов, имеющих важное биологическое значение. Наиболее прямой из них выражается в следующем; способность репрессора очень быстро связываться с оператором не соответствует времени, которое требовалось бы для множественных диссоциапнй и реассоциаций комплекса репрессор — ДНК. Это исключает наличие механизма беспорядочного поиска оператора и дает основание думать, что репрессор способен пере- 187 14.
Оперон на примере организации лактозных генов Парадокс индукции ьрлюхачаьалах ЯЯрашб чх( рчлха(йвх %юРТЖЮЯЯлюжбю'. %аль рлК 'ч щ СХР 1 Дабввлвл 8 авврвуарв лву рвлрм- .Гллдувтар сара . хаак ааьаашахааруачаваажж аа мачвьвчачвхахавххлачааачаг хрчаьвхх П1 (21 Илдукуар( удален ф ахахычгчхаьдацрчакдхлаявкагахчххвласчЯмЬасаохххщчвтяямамь' у~ Т аьшлдаъЯауыуачазаваьхв(ц (цъ ацхххававшачахчхчпакг (З1 Ячахчучрбачршча хрхчыраьвчльвххрьвчвчаьаьлчшвчалаКФ~д~ шачачлчлхчхчуьача С.-СЭ С:ХЗ И( Рцс.
14.10. Освобождение рецрессора связано с общим изменением его структуры, ослабляющим ксе его контакты с оператоРом. Показано кзмвквцкс угла наклона, образуемого между Н-какцввым участкам к кядрамл, после црцсаадяцвцля ккдуктарл к раарвааару. двигаться непосредственно от случайного сайта в ДНК к оператору. Движение может осуществляться либо очень быстрым скольжением по ДНК (которое, по-видимому, нереально из-за помех, создаваемых другими„связанными с ДНК белками), либо путем непосредственного перемещения из сайта в сайт.
Последнее может происходить с помощью того же механизма, который мы уже обсуждали в случае РНК-полимеразы (гл. 10). Реакцию перемещения может облегчать наличие большего числа (четырех) сайгон связывания в расчете на тетрамер, чем на самом деле используется для контактов с ДНК в любое данное время (два из четырех).
Способность большого числа неспецифических сайгон успешно конкурировать с небольшим числом сайтов с высоким сродством свидетельствует о том, что связывание репрессора с оператором должно отличаться высокой чувствительностью как к общей концентрации ДНК, так и к общей концентрации репрессора в клетке. Разница в степени выражения лактозного оперона в его индуцированном и репрессированном состоянии может быть Рис. 14.!1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
