Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 75
Текст из файла (страница 75)
Нам известно, что эти участки должны находиться между Р! и в одной транскрипционной единице и между Рк и гк, -в другой. Где же точно они расположены? Их можно картировать с помощью гибридов фага лямбда с другими фарами, у которых имеются замены в определенных участках генома, либо с помощью делеций в ДНК фага лямбда, предотвращающих антитерминацию, а также путем выделения точковых мутаций лиу, блокирующих антнтермннацию. С помощью таких экспериментов удалось локализовать циИ.между стартовой точкой промотора Рс и началом области, кодирующей ген сУ; лией находится между концом гена ого и терминатором гк,. Как видно из рис. 13.8, это означает, что оба сайта располагаются в совершенно различных областях соответствующих транскрипционных единиц.
В то время как ли!1. находится в начале, про пигй можно сказать, что он расположен близко к терминатору. Как же осуществляется антитерминация? Когда белок р1к! узнает сайт лш, он должен провзаимодействовать с РНК-полимеразой в этом сайте, модифицировав ее таким образом, что она в дальнейшем, находясь на терминаторе, уже не о~нечаст на фактор р. Различная локализация сайгон пиг указывает на то, что это событие не связано ни с инициацией, ни с термннацией, а осуществляется под действием РНК-полимеразы в момент элонгации РНК в сайте лш.
Затем РНК-полимераза становится в такой степени 13. Терьгинация и антитерминация 171 Рис. 133 Белок РХ связывается с РНК-полимеразой, когда она единую мРНК, содержаэпую последовательности, соответствую- проходит через сайт лш. В результате фермент становится спо- шие как задержанно Раяним, так и предранним генам. собным преодолеть терминаторы гь, и га„образуя при этом Существуют ли дополнительные субъединицы у РНК-полимеразы? неконтролируемой, что преодолевает терминатор, не обращая внимания на его сигнал. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК выявил два участка из 17 пар оснований, идентичных, за исключением одной нуклеотндной замены, и одинаково ориентированных по отношению к направлению транскрипции. Последовательность лш включает инвертированный повтор из 5 пар оснований, две копии которого разделены несимметричной областью следующим образом: А Ц С, Ц,О.Т,.О А А Ры А;А,.Ц',:йчпэф А Т О.
ц 6'6' А.С Т Т Ру Тзт' ц'жяц..Ф':Т где окрашенными прямоугольниками обозначены инвертированные повторы, а пара оснований Рп — Ру указывает на единственное различие между лисьи лией. Является ли способность белка рХ узнавать короткую последовательность в транскрипционной единице примером более широко используемого механизма антитерминации? Существуют другие фаги, родственные лямбда, которые имеют различные гены Х и различную антитерминаторную специфичность. Область фагового генома, в которой находятся сайты лиг, имеет различную последовательность у разных фагов, и, вероятно, каждый фаг обладает только ему свойственными сайтами лш, которые специфически узнаются собственным белком рМ Каждый из этих белков рХ должен обладать одинаковой способностью взаимодействовать с транскрипционным аппаратом, осуществляя антитерминаторную функцию, но при этом иметь различную специфичность по отношению к последовательности ДНК, активирующей этот процесс.
Открытие антитерминации как фагоспецифического механизма помогло обнаружить другие бактериальные белки, являющиеся компонентами транскрипционного аппарата. Бактериальные белки, с которыми взаимодействует белок р)х) в процессе функционирования, могут быть выявлены с помощью мутантов Е. со)1, в которых белок р)ь) не может обеспечить антитерминацию. Эти мутанты резистентны к инфнцированию фагом лямбда, так как в этих клетках фаг способен экспрессировать только свои предранние гены. Некоторые из этих мутаций картируются в гене гроВ. Это свидетельствует в пользу того, что белок р)х) взаимодействует с ))-субъединицей минимального фермента. Другие мутации Е, со)Е блокирующие функцию белка рХ, расположены в генах, не кодирующих компонентов РНК-полимеразы.
Они обозначаются как локусы лиз, которых насчитывается по крайней мере трн: лизА, лизВ и пизЕ (от англ. Ж пГй)хаГ)оп апьмапсе . М утилизирующая субстанция). Локус ли» должен кодировать белки, которые являясь частью транскрипционного аппарата, не выделяются в составе обычной формы РНК-полимеразы. Функции, контролируемые лизА и лиаВ, по-видимому, имеют отношение исключительно к термнннрованию транскрипции, в то время как лизЕ оказывается идентичен локусу грзэ', кодирующему рибосомный белок Б10. Вероятно, функция белка Б10 при транскрипции отличается от той функции, которую он выполняет в рибосоме, хотя вполне возможно, что этот белок принимает определенное участие в сопряжении процессов транскрипции н трансляции.
172 Часть П1. Синтез РНК Функция, контролируемая лизА, в значительной степени связана с действием белка рХ. Можно получить мутации по гену Х, которые преодолевают блок антитерминации, обусловленный мутациями лизА. Предположение о том, что лиэА необходим для функционирования белка рХ, подтверждается тем фактом, что !и тйго два этих белка связываются между собой, (лизА является одним нз двух белков, прочно связывающихся ш чгго с белком РХ. Второй белок — это полипептид с мол. массой 25 000 дальтон с неизвестной генетической природой и функцией.) рХ представляет собою маленький (13500 дальтон), сильно щелочной и довольно асимметричный по форме белок. Мы пока еще не располагаем удовлетворительной системой ш ч1го для изучения его функции.
Продукт гена лиэА является кислым белком с мол. массой 69000 дальтон. 1и чгго он функционирует как 4актоР теРминации на сайгак гьз и гкз фага лЯмбда, которые классифицированы как р-независнмые сайты; они располагаются дистально по отношению к р-зависимым сайтам 11, и 1к,. Фактически суть действия белка ХнзА состоит в том, что он вызывает остановку РНК-полимеразы на этих терминаторах на длительное время-около !5 мин.
Для освобождения новосинтезированной цепи РНК требуется присутствие фактора р, но в очень низких концентрациях, которые сами по себе не эффективны в отсутствие ХпзА-белка. Это свидетельствует в пользу того, что действие белка ХнзА нетождественно действию фактора р, а дополняет его. Генетические эксперименты показывают, что мутации лизА и иизВ обладают сходными свойствами (обе супрессируют полярность, как можно было бы предполагать из-за отсутствия фактора терминации); поэтому, по-видимому, онн функционируют аналогичным образом.
Белок ХивА связывается с минимальным ферментом, но не взаимодействует с голоферментом. Однако при добавлении сигма-фактора к комплексу а,бб'ХнзА он замешает белок ХнзА, восстанавливая, таким образом, структуру голофермента аз(3)3дъ Можно полагать, что РНК- полимераза совершает цикл, изображенный на рис. 13.9, в котором она существует поочередно либо в форме фермента, готового к инициации (аз!3(3'а), либо в форме фермента, готового к терминации (изб(3'ХнзА).
В гл. !О мы уже описывали, что инициация происходит поэтапно. Голофермент изб(3'о связывается с промотором и освобождает сигма-фактор. Это приводит к образованию минимального фермента из!30', способного осуществлять элонгацию. Затем белок ХнзА узнает минимальный фермент и связывается с ним, образуя комплекс ц !3(3'ХнзА. Мы не знаем, на каком этапе это случается; это могло бы произойти как в любой момент элонгации, так и просто в сайте терминации. В любом случае, пока комплекс изЩ3'ХнзА связан с ДНК, компонент ХнаА не может быть вытеснен.
Но когда терминация произошла, фермент переходит в состояние, в котором ХнзА или автоматически отделяется от минимального фермента, или может быть замешен сигма-фактором. С точки зрения минимального фермента жизнь состоит из чередования процессов ассоциации с сигма- фактором для инициации или с белком ХцзА для терминации. Одновременное взаимодействие обоих факторов с минимальным ферментом невозможно. Нет основания считать один фактор более присущим ферменту, чем другой, поскольку оба они, по-вндимому, его альтернативные компоненты. Таким образом, выделение минн- мального фермента представляет собой получение формы РНК-полимеразы, способной осуществлять основную функцию при синтезе РНК, но лишенной субъединиц, необходимых для других функций.
Как мы уже отмечали, до конца не ясно, где проходит граница между собственно минимальным ферментом и полным транскрипционным комплексом. По-видимому, фактор ХизА обеспечивает связь между белком рХ и минимальным ферментом. Это приобретает смысл при условии, что белок ХнзА является терминационной субъединицей, чье присоединение к ферменту обеспечивает специфичность по отношению к определенным терминаторам. Таким образом, белок рХ может действовать как антитерминатор, мешая ХшА проявлять функцию, необходимую для терминации. Отсюда напрашивается вывод, что бактерия-хозяин может, вероятно, содержать другие белки, аналогичные ХнзА (или рХ), чьи взаимодействия с минимальным ферментом контролируют узнавание сайтов терминации.
Это заключение объяснило бы любопытный факт, касающийся ХизА. Он идентичен белку, ранее описанному как фактор 1., который необходим для транскрипции !и ч1го некоторых генов. Это свойство не имеет ничего общего с тем, что можно было бы ожидать от фактора терминации. Но если именно присутствие белка ХнзА позволяет этим гипотетическим бактериальным функциям подавлять терминацию в определенных сайтах, то ХпзА мог бы быть необходимым для транскрипции любого гена, расположенного за таким сайтом.
Возможно также, что сама субъединица ХнзА могла бы придавать минимальному ферменту способность прочитывать некоторые 1-сайты и в то же время распознавать другие. Пока еще мы не располагаем точными сведениями о том, как взаимодействуют белок ХизА, минимальный фермент и фактор р при терминации, но идентификация ХивА как терминаторной субъединнцы, а также существование фаговых белков рХ, различных по специфичности, но, несмотря на это, по-видимому, способных взаимодействовать с лиэА, предполагают возможность существования целого ряда других (неизвестных) факторов, влияющих на минимальный фермент или модифицирующих его свойства. Это означает также, что минимальный фермент, возможно, сам по себе не способен осуществлять терминацию, и поэтому эксперименты ш ч1го по терминации с минимальным ферментом могут неадекватно отражать его свойство.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
