Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 208
Текст из файла (страница 208)
Например, Тп903 и 1Я могут примерно с равной частотой осуществлять транс- позицию и формировать коинтеграты. Однако у Тп5 и Тп!0 транспозиция происходит примерно в 50-200 раз чаще, чем образование коинтегрированных структур. Коинтеграты, образуемые при участии Тп5, отличаются стабильностью. Это позволяет предположить, что их образование — результат транспозиции, а не промежуточный продукт этого процесса. Модель транспозипин, по которой коинтеграт представляет собой обязательный промежуточный продукт, иллюстрирована на рис. 36.11.
Четыре одноцепочечных разреза инициируют процесс. Донорная молекула разрезается в каждом конце транспозона с помощью сайтспецифического фермента, который узнает его конец. Молекула мишени разрезается в сайтах, расположенных ступенчато, обычно на расстоянии 5 или 9 оснований друг от друга.
Порядок и время, в которое производится разрез во время транспозиции, могут быть изменены. Разрезы в цепях донора и мишени ошиваются. Каждый конец последовательности транспозона присоединяется к одному из одноцепочечных концов, образовавшихся в сайте мишени. В результате образуется сЬ|-образная структура, удерживаемая двухцепочечной ДНК транспозона. Образование такой структуры приводит к перемещению транспозона'„ферментативная активность, ответственная за такое перемещение, получила название транснозазы. Сй(-образная структура содержит одноцепочечную область в каждом из ступенчато разрезанных концов.
Эти области используются в качестве псевдореплнкационных вилок, обеспечивающих матрицу для синтеза ДНК.(Использование концов в качестве затравок для репликации означает, что должен иметь место разрыв цепи с полярностью, в результате чего в этой ~очке образуется Зчконец.) Если репликация продолжается от обеих репликационных вилок, она идет через трапспозон, разделяет его цени и терминируется в его концах. Репликация выполняется, по-видимому, с помощью ферментов, кодируемых клеткой-хозяином.
По окончании репликацни структура становится коинтегратом, обладающим прямыми повторами транспозона в местах соединения между репликонами (в чем можно убедиться при анализе последовательности, составляющей коинтеграт). Сайтспецифическая рекомбинация между двумя кониями транспозона может восстановить исходный донорный репликон, освободив при этом репликон мишени, который приобрел транспозон. Такое событие получило название разреп|ения; фермент, ответственный за эту активность, называется резолвазой. Транспозиция ТпЗ происходит путем разрешения коинтеграта Существуют большие (- 5 т.п.н.) элементы, транспоэицня которых не зависит от модулей 18-типа. Они представляют собой независимые единицы, несущие как гены, кодирующие функции транспозиции, так и гены, кодируюшие рсзистентность к антибиотику.
К наиболее изученным транспозонам такого типа относятся представители семейства ТпА. Первоначально полагали, что оно включает только один транспозон, однако их обнаружено много (табл. 36.3). Транспозиция этих элементов осуществляется в две ступени: сначала образуются коинтеграты, а затем эти коинтеграты разрешаются. Каждая стадия проходит при участии различных продуктов, кодируемых транспозоном (в отличие от единственного белка транспозиции 1Б-элемента). Так же как у элементов типа 15, в этом случае в с~адин транспознции участвуют концы элемента.
Уникальным свойством транспозонов ТпА-семейства являет- 36. Транспознрующиеся элементы бактерий 467 Мнывнн / 1? !! ! /! / трлнспопон / ?/ ! !! /! / Ф !! / ° !! / Ф ! / ! !! !! Рпнамб и вмм к оппо ( Ролл кон оо вмлвной ! - Ископный реплнко !! / Рпс. 38.1!. Один из путей тркиспозицпи ведет к образованию копптегратов, которые разрешаются рекомбпнацпей. Таблица 36.3 Семейство трапеппзппоп Тпд прелетйвлепп большпмя, пп тем по менее пплцппдуйльпымп вдпппцймп Длина, л. и.
Зло- мопг Гопотк- Выбор мпшопи чоикне маркеры атр 38 итр ? к ? 37 Н8 38 Региональный в Неизвестный ТпЗ 4257 Тп! 5000 '78 5800 :Тп501 8200 Ипворгпроваппыо копповыо повторы, п. и. Флапкпруюшпе повторы мишени, и, к. ся то, что их стадия разрешения требует специфического внутреннего сайта. Транспозоны ТпА обычно на концах имеют близко- родственные инвертированные повторы длиной около 38 пар оснований. Цпс-активные делеции в любом из них предотвращают транспозицию элемента, В сайте-мишени образуются прямые повторы из 5 пар оснований, выбираемых случайно, хотя и с региональной предпочтительностью. С помощью рецессивных мутаций идентифицированы два гена, продукты которых необходимы для транспозиции.
Так как мутантные гены могут быть комплементированы в транс-положении генами дикого типа другой копии транспозона, их действие не проявляет цпс-активной предпочтительности, характерной для транспозиционного процесса 18-типа. Мутанты по гену шрА не способны осуществлять транспозицию. Продукт этого гена — транспозаза — состоит из 1021 аминокислоты (примерно 120 000 дальтон). Очищенный белок способен связываться с одноцепочечной ДНК. О его функции известно немного, хотя показано, что он необходим для узнавания концов элемента и для осуществления ступенчатого разреза с промежутком между разрезами на отдельных цепях в 5 пар оснований В месте ступенчатого разреза происходит соединение концов транспозона с ДНК мишени. Транспозазы ТпЗ и родственного элемента уб эффективно работают только на свой собственный тип транспозона, хотя концы элементов одинаковы на участке в 27 из 38 пар оснований инвертированных повторов. Возможно, что неко~орые из отличающихся позиций представляют собой критические точки при узнавании концов.
Ген глрК кодирует белок из 185 аминокислот (23000 дальтон). Различный эффект мутаций в этом гене свидетельствует о двойной функции кодируемого им белка. Этот белок действует как репрессор экспрессии гена и обеспечивает функцию резолвазы. Мутации в гене глрК увеличивают частоту транспозиции. Причина такого эффекта заключается в том, что ТпрК репрессирует транскрипцию как гпрА, так и своего собственного гена. В результате инактивация белка ТпрК ведет к увеличению синтеза белка ТпрА, что в свою очередь обусловливает возрастание частоты транспозиции. Следовательно, количество транспозазы ТпрА служит ограничивающим фактором в транспозиции. Гены гпрА и гпрЯ транскрибируются дивергентно от А — Т-богатой межцистронной контролирующей области длиной в 163 пары оснований, как показано на карте транспозона ТпЗ, представленной на рнс.
36.12. (Другие транспозоны ТпА-типа имеют такую же организацию.) Оба эффекта белка ТпрК проявляются при его связывании в этой области. Белок ТпрК, функционируя в качестве резолвазы, вовлекается в рекомбинацию между прямыми повторами ТпЗ в структуре коинтеграта. Коинтеграт представляет собой обязательный промежуточный продукт при транс- позиции; разрешение коинтегратов блокируется в мутантах гарК, что ведет к образованию только коинтегрированных структур.
В принципе коинтеграты могут быть разрешены с помощью гомологичной рекомбинации между любой соответствующей парой точек в двух копиях транспозона (рис. 36.11). Однако на деле реакция разрешения происходит только в специфическом сайте. Этот сайт первона- 468 Часть Х. Динамичность генома: постоянное изменение ДНК са алр' И с рд ж спря 001 Зб пл Зобб гй ма .р ~г 1 1 1 1 я в 1 спрд бид '! Либр~~пуз спрн 'ч — бб 0 Чсбб рпс. 30.12 Транспозоны, подобные Тпз, имеют инвертированные концевые повторы, внутренний сайт геп н трн известных щна.
Сзрялкямп укязыяапсоя няпрявченпп вырсжеппя кодпрующпк областей. Цифры я апркппй части диаграммы указывают длину кяждой обляотп. Цифры в нижней чзстн диаграммы показыляюч ряоосояппя от тачки перекреста (О). чально был идентифицирован иис-действующими делециямн во внутренней области, которые блокируют завершение транспозиции, вызывая накопление коинтегратов.
Сначала сайт был обозначен как Жб (от англ. га(егпа( гела(и((оп зе((пенсе); теперь он известен как гез-сайт. В отсутствие гез реакция разрешения может быть замешена КесА-зависимой обшей рекомбинацией, но она происходит со значительно меньшей эффективностью. Сайты связывания резолвазы ТпрК удалось определить с помощью метода отпечатков комплекса ДНК вЂ” белок. Данные об их локализации суммированы в нижней части рис.
36.12. Связывание происходит независимо в каждом из трех сайтов длиной в 30 — 40 пар оснований. Сайт 1 включает область, генетически идентифицированную как гея-сайт; в его отсутствие реакция разрешения не происходит вообще. Однако рчзрешение включает также связывание в сайтах 11 и П1, поскольку при делеции любого из них реакция разрешения идет с низкой эффективностью. По-видимому, сайт ! перекрывается со стартовой точкой транскрипции (прА. Сайт 11 перекрывается со стартовой точкой транскрипции (арЯ; мутация оператора картируется в самом левом конце сайта. Три сайта связывания в ТпЗ несут гомологичную последовательность, которая определяет каноническую (усредненную) последовательность; имеется двойная симметрия в сайтах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
