Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 209
Текст из файла (страница 209)
Как они взаимодействуют между собой? Одна из возможностей сводится к тому, что связывание во всех трех сайтах необходимо для удержания определенной топологической конформации в ДНК; реакция разрешения может начаться, когда комплекс ДНК вЂ” белок одного транспозона будет взаимодействовать с таким же комплексом другого транспозона. Связывание только в одном наборе сайтов может репрессировать транскрипцию генов (прА и шрй, не вызывая каких-либо изменений в ДНК.
Область, в которой происходит сайтспецифическая рекомбинация, впервые была идентифицирована при сравнении реакций транспозонов ТпЗ и уб, у которых гены (прй проявляют высокую гомологию и могут замещать 5' 3' ТТЛТАА ААТАТТ 3' 5' 5' ТТЛТ 3' А А-белок белок-А А 3' ТАТТ 5' На основании родства сайта гея с корам ан-сайта фага лямбда (гл.
35) можно предположить наличие сходства между этой системой н сайтспецифической рекомбинацией фага лямбда. Между лвумя сайтами существует гомологня в 10 из 15 пар оснований, непосредственно окружающих точку перекреста, Ниже представлены этн последовательности: гея О А Т А А Т Т Т А!Т А А Т А Т ан О С Т Т Т1Т Т Т А Т А С Т А А Стрелками показаны сайты, в которых белок ТпрК разрезает покус ген а белок 1п(-ан, Сами по себе реакции аналогичны, хотя здесь разрешение происходит только между внутримолекулярными сайтами, в то время как рекомбинация между а((-сайтами является межмолекуляр.
ной и направленной (что обусловлено различиями ан-сайтов). В обоих случаях очевидно сходство с реакциями друг друга в комплементационных исследованиях. Последовательности рекомбинантов свидетельствуют о том, что реакция разрешения происходит в пределах 19 пар оснований сайта 1, идентичных в обоих транспозонах. Значительно больше информации о реакции разрешения было получено в опытах по разрешению коинтегратов ш у((го.
В качестве субстрата в этих экспериментах использовали коинтеграт-подобную молекулу ДНК. (Субстрат был сконструирован путем клонирования с образованием прямых повторов в двух областях плазмиды рВК322.) Субстрат должен иметь суперспиральную структуру; его разрешение ведет к образованию сцепленных колец, каждое из которых содержит один геч-сайт.
Реакция требует присутствия больших количеств резолвазы ТпрК (которую получают в нужном количестве благодаря применению стандартных методов клонирования). Разрешение происходит наиболее эффективно при соотношении ферментссДНК, равном примерно 20,'1. Факторы хозяина в этой реакции не требуются (в противоположность сайтспецифической рекомбинации фага лямбда).
Разрешение — консервативный процесс; связи при этом разрываются н восстанавливаются без поглощения энергии. Для завершения реакций необходимы ионы магния; если они отсутствуют, происходит лишь частичная реакция с низкой эффективностью. В результате такой реакции получаются продукты, соответствующие промежуточной стадии в разрешении коинтегратов; они состоят из резолвазы, коваленпю связанной с обоими концами, образовавшимися при двухцепочечном разрезе, произведенном в гея-сайте, Разрезание производится симметрично в коротких палиндромных областях; в результате образуются выступы из двух оснований. Развивая представление об области перекреста, расположенной в сайте 1, мы можем описать реакцию разрезания следующим образом: 36.
Траиспозирующиеся элементы бактерий Рцс 3613 Порядок генов в профаге и свободной ДНК фага Мц одинаков, но концы различны. ДНК профага флаикнрована прямыми повторами нз 5 пар оснований ДНК хозяина, Свобол- разрезания и воссоединения, осушествляемыми топоизомеразами. Наконец мы должны упомянуть поразительный эффект транспозона ТпЗ, получивший название иммунитета транспозииии. Плазмида, несущая транспозон Тп3, иммунна к внедрениям любого ТпЗ-элемента, вносимого на другой молекуле ДНК (хотя ТпЗ, по-видимому, способен транспозироваться в пределах плазмиды). Существует определенный лат-период между внедрением Тп3 в новую плазмиду и установлением иммунитета.
Эффект специфичен; он относится только к Тп3 и не предотврашает внедрения других транспозонов в плазмиду. Природа такого яис-действия на далеком расстоянии остается загадочной. Некоторые необычные свойства транспозирую)него фага Ми Фаг Мц может находиться в клетке в альтернативных состояниях, осуШесгвляя литический цикл или лизогепизируя клетку. Он был открыт благодаря его способности вызывать мутации в Е. сей. Мутации возникают при внедрении фагового генома, содержащего 37 т.п.н., в случайные сайты (с региональной специфичностью) бактериальной ДНК. При этом реверсий с доступной определению частотой не происходит. Карта генома фага Мц показана на рис. 36.13. Внедренный геном Мц имеет тот же порядок генов, что и свободная фаговая ДНК, которая имеет линейную форму.
(Следует отметить сушествуюшее отличие от фага лямбда, свободная линейная ДНК которого при инфекции образует кольцевую молекулу; в результате интеграции образуется линейный профаг, порядок генов которого является пермутированным отггоснтельгго порядка генов свободной ДНК фага.) Линейные геномы фага Мц не содержат ни липких концов, ни повторов; поэтому не ясно, каким образом осуществляется согласованное действие концов во время интеграции. Возможно, что реакция зависит от гомологии, которая встречается на расстоянии примерно 100 пар оснований от каждого конца.
Сугцествование механизма, узнающего специфические концы иптег рнрованной последовательности фаг а Мц. быдо обнаружено при открытии способности этого фага вырезаться. Реакция происходит только в том случае, если профаг Мц приобретает 1о)-элемент. Механизм вырезания неизвестен, однако установлено, что в него вклю- ная фаговая ДНК содержит различные дополнительные после- цовательноспг в левом конце длиной в !00 пар оснований и в правом конце (1500 цар оснований) чены как функции, кодируемые Мц, так и функции, контролирусмыс 131-элементом. Концы свободной ДНК фага Мц обладают дополнительным материалом, который не является частью фагового генома. Фактически концы представлены последовательностями генома хозяина.
Левый конец содержит около 100, а правый — около 1500 пар оснований (они обозначены соответственно как с- и Я-концы). В отдельных молекулах ДНК фага Мц эти последовательности различны; они приобретаются при упаковке фага из прелшественпиков, в которых фаговый геном фланкирован последонательностями хозяина. При внедрении фагового генома в бактериальную хромосому дополнительные области теряются. Инфицирующая ролительская ДНК фага Мц внедряется в геном хозяина неэффективно. Ьольшинсгво молекул ДНК во время лнтического цикла сохраняет свои свободные концы. Менее 10; инфицирующих фаговых гепомов внедряются. Олнако во время репродуктивного цикла последовательности ДНК фага Мц внедряются эффективно. Этот парадокс показывает, что копии ДНК Мц, образуемые при репликации, способны внедряться в геном хозяина.
В родственной реакции индукция профага Мц, ведущая к вступлению в литический цикл, не сопровождается вырезанием фаговой ДНК из хромосомы хозяина. Снова ведущую роль в этом цикле играет продукт репликации. Связь между интеграцией н рсплнкацией обнаружена при изучении мутантов фага Мц, неспособных к интеграции. Оказалось, что и репликация у этих мутантов нарушена.
Мутации, определяющие такую дефскпюсть фага, локализуются в одном из двух генов, А или В, необходимых для репликацни фага. Таким образом, интеграция, по-видимому, зависит от функции репликации, а не от специальных рекомбинационных ферментов (как у фага лямбда). Существуют два пути внедрения фага Мц. В результате простых внедрений Мц образуются лизогенные бактерии, содержашие профаги. Обнаружено присутствие прямых повторов из 5 пар оснований с каждой стороны от профага, что указываез на сходство этого события е транспозицией. Кроме того, в процессе литического развития почти все продукты Мн-опосредованной транс- позиции имеют структуру коинтегратов. Нам не известно, являются ли простые внедрения и коинтеграты ре- 470 Часть Х.
Динамичность генома: постоянное изменение ДНК зультатом альтернативных взаимодействий ДНК фага Мц с ДНК мишени или они представляют собой разные конечные продукты одного общего предшественника. Основные механизмы транспозиции фага Мц пока не изучены. Другое необычное свойство фага Мц связано с наличием в его геиоме, вблизи правого конца, сегмента О, или инвертируемого сегмента. Он имеет протяженность около 3 т.п.н.
и в различных молекулах ДНК фага Мц представлен в различной ориентации. У фага, полученного в процессе литической инфекции штамма Е. сой К!2, О-сегмент всегда находится в ориентации, получившей название О(+ ). Если же фаг получают в результате индукции, его ДНК может содержать О-сегмент либо в этой же, либо в противоположной, О( — ), ориентации. Для осуществления инверсии требуется ген фага Мц, названный 8!и и локализованный сразу же за пределами О-сегмента. Сегмент О содержит в своем составе гены, которые кодируют белки, вовлекаемые в процесс адсорбции фага.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
