Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Условно летальными мутация.ии называются мутации, летальные при одних условиях (называемых неиермиссивными или рестриктивными) и не влияющие на размножение фагов в других условиях (нермиссивных). Эти мутации позволяют идентифицировать и изучать большую часть генов фага. Первыми условно летальными мутациями, изученными в генетике фагов, были гП-мутации фага Т4. Система гй'бактериофага Т4 Классический анализ тонкой структуры гена был проведен Сеймуром Бензером на гП-мутантах фага Т4 в 50-х годах. Бензер использовал два селективных преимущества этих мутантов. Во-первых, гП-мутанты можно отобрать в большом количестве, поскольку при посеве на Е. сой В их негативные колонии имеют очень характерную морфологию.
Эти мутанты вызывают быстрый лизис клеток-хозяина, в результате чего их негативные колонии получаются намного крупнее, чем при заражении фагом дикого типа (рис. 6.1), На чашке Петри одна-единственная бляшка гП легко может быть выделена из 2000 бляшек типа гП '. Использование химических мутагенов сильно повышает частоту мутаций гП по сравнению со спонтанной; соответственно независимо могут быть выделены сотни мутантов гП. Во-вторых, Бензер обнаружил, что гП-мутанты не дают потомства, когда они инфицируют клетки Е. сой К ().)„содержащие профаг г.. гП- мутанты прикрепляются к таким клеткам и вводят в них свою ДНК, но инфицированные клетки погибают, не продуцируя фагового потомства.
162 Таблица бд. Морфология негативных колоний фага Т4 дикого типа и г!1-му- тантов Фенотипы при посеве на: Е соб К (Х) Мелкие бляшки бляшки отсутствуют (ле- таль) Е сод В Мелкие бляшки Крупные бляшки шаг Т4гПт Т4 гП В то же время фаг Т4 дикого типа (г11ч) нормально размножается в Е. сей К (Х). Это была первая условно летальная система, исследованная в генетике фагов (табл. 6.(). Неспособность г11-мутантов к росту в Е.
сой К (Х) дает удобный способ отбора, поскольку на чашке Петри таким способом можно выделить один гП -фаг из 10о гП-фагов. Следовательно, имеется возможность идентифицировать фагн дикого типа, возникающие в результате рекомбинации между двумя различными г11-мутантамн. На рис. 6.2 представлена схема эксперимента по скрещиванию бакте- А "В АВ' Одновременное эаранение в пермиссивных условилх Посев в пермиесивных условиях плл опенки суммарной численности всех генотипов: Посев в иепермиссивных условиях ппя определения числа потомков с рекомби нантным генотипом А В' АВ' АВ АВ А'В Рис.
6.2. Схема скрешиввния двух мутантпых фатов, А и В Скрешивание осушествляют путем совместного заражения бактерии-хозяина в пермиссивпых условиях. Организация и передача генетического материала 6. Тбнкая структура гена 163 риофагов. Клетки пермиссивного хозяина (штамма В) заражанэт двумя мутантами, затем подсчитывают общее число потомков при высеве на клетки штамма В и число гП'-рекомбинантов. Для этого в качестве хозяина используют штамм К(Х). Так как реципрокные рекомбинанты, т.е. двойные мутанты гП, при этом не выделяются, то считают, что частота их появления совпадает с частотой рекомбинантов дикого типа.
Поэтому при расчете расстояния на генетической карте число рекомбинантов дикого типа умножается на два: 2 Число потомков типа гП + 100 (6. ! ). Общее число потомков Природа мутаций в области гП' Таблица 6.2. Характеристика восьми гП-мутантов фага Т4 Мутант Положение нв «врте Чистоте реверснй < 0,01.10 <10.10 е 45.!О " <02-10 е !О-е <1010 е !70.!О < ойц .!о-' г47 г104 г!01 г103 г105 с!06 г51 г102 0 1,3 2,3 2,9 3,4 4,9 6,7 8,3 По Венеег 5., 1955 Ргос.
!ив!1. Асад зсг ПКА, 41, 344. н* В модели структуры ДНК Уотсона и Крика предполагается, что замена одной нуклеотидной пары в нормальной нуклеотидной последовательности гена может привести к формированию мутантного фенотипа. Можно предположить, что мутация, в основе которой лежит замена одной нуклеотидной пары, должна обладать следующими свойствами; 1) обратные мутации, переводящие мутантный фенотип в нормальный, должны происходить примерно с той же часто~ой, что и прямые; 2) ей должна соответствовать определенная точка на генетической карте; 3) такая мутация должна обладать способностью к рекомбинации с любыми другими точечными мутациями, за исключением тех, которые представляют собой независимые замены той же нуклеотидной пары. Некоторые из изученных Бензером гП-мутантов обладали перечисленными свойствами, другие -нет.
Данные, представленные в табл, 6.2, показывают, что частота обратных мутаций к дикому типу у различных гП- мутантов, способных к рекомбинации друг с другом, сильно различается. Некоторые из гП-мутантов вполне стабильны и не ревертируют к дикому типу (т. е. не дают бляшек на Е. соб К(Х)); другие ревертируют к дикому типу с измеримыми и характерными частотами. Генетическая карта гП-мутантов, представленных в табл. 6.2, изображена на рис.
6.3. Результаты рекомбинационного анализа более широкого набора из 60 независимо полученных гП-мутантов представлены на карте Оргинизаиич и передача генетического материила «47 г104 «101 «103 г105 «100 «51 «102 10 единиц карты мг 4«.и ! П 4 — А цистрон+В цистрон -9 М« «О4 191 192 «Обпвб М 1О1 ИИИ 1И И1ВН1 В1!1 1 11 ! ! 1И 1!В!И!1 1 б 1 единица карты 19б 187 295 1бб 145 282 ггб 201 155274 271279 240 114 151280217 150 о,ихю О,О1З 0,017 о, о, о, о, а, о, о, О,ООСО окою а,сею с,ахю о,сюоо о,саю о,охю о,оооо о,оооо а,оооо. Рис. 6.4.
Карта тонкой структуры нескольких участков области гП фата Т4. Числа между стрелками на картах участков а, Ь, с н д означают процент рекомбинантов дикого типа, Рис. 6.3. Генетическая карта гП-мутаций фага Т4, приведенных в табл. 6.2. Цифры над стрелками указывают расстояния.
(Вепгег 5. (1955). Ргос. Ха!1. Асад. Бсь, (ЛА, 4К 344.] возникающих при попарных скрещиваниях между мутантами. (Вепгег 5. (1955). Ртос. Ха!1. Асад, Яс!., ()БА, 41, 344.] 165 б. Тонкая структура гена г16 8 Д г1695 г 924 3 Ряс. 6.5. Схема, иллюстрирующая механизм сокрашения генетического расстояния между фланкирующими маркерами при скрещивания фаговых мутантов, несущих делению в одном я том же участке. [1сотига М., Веяяег 8. (1961). 1. Мо1. Вю1., 3, 684.~ г 16В г 1695 Й 1695 924 М (рис.
6.4). Тщательное изучение этой карты показывает, что некоторые из гП-мутантов (а именно не ревертнруюшие к дикому типу) рекомбинируют, давая гП+ потомство не со всеми остальными гП-мутантами, но лишь с некоторыми из них. Соответственно эти мутации занимают на генетической карте участки большие, чем точечные мутации (размер участка зависит от конкретной мутации), и изображены жирными черными линиями, перекрывающими на карте мутации, с которыми они не рекомбинируют. Например, рассмотрим карту области а на рис. 6.4. Мутант 168 рекомбинирует с мутантами 295 и 312, но ни один из этих трех мутантов не дает рекомбинантов дикого типа с мутантом 47. Все этн четыре мутанта рекомбинируют с мутантами 145, 282 и 228.
Если мутанты 168 и 295 — это точечные мутации, то мутант 47 лолжен возникать в результате изменения более чем одной точки на генетической карте (т.е, изменения более чем одной нуклеотидной пары). Относительно мутантов типа 47 было показано, что они прелставляют собой делеции многих последовательных ггар нуклеотидов. Исследование рекомбинации двойных гП-мутантов показало, что такие мутации как бы вырезают из генетической карты участки, расположенные между фланкирующими генетическими маркерами, это неудивительно, поскольку у таких мутантов физически отсутствует участок ДНК межлу этими маркерами (рис.
6.5). Из этих исследований был сделан важный вывод: фенотипически неразличимые гП-мутации могут быть следствием либо замены отдельной нуклеотидной пары, либо делеции некоторого числа пар нуклеотидов. Свойства, обнаруживаемые у таких делеций, нельзя считать неожиданными. Действительно, врхп ли утрата некоторого числа нуклеотидных пар может быть обратимым процессом, поскольку при этом должны восстанавливаться точное число и последовательность этих пар. Аналогично скрещивание между носителем такой делеции и штаммом с точечной мутацией, расположенной в участке, отсутствующем у партнера по скрещиванию, не должно приводить к появлению рекомбинантов дикого типа.
Ни один из геномов, участвующих в таком Организация и передача генетического материала 166 скрещивании, не содержит нужной нуклеотидной пары в месте точечной мутации. Следовательно, восстановление нуклеотидной последовательности дикого типа невозможно.
Функциональные особенности гЫмутаций Генетический анализ состоит в экспериментальном изучении отношений, существующих между мутантами, Для определения характера этих отношений используются два основных приема-рекомбиназ(ионный тест и тест на комнлементанию.
Рекомбннационный тест, как мы уже отмечали в предыдущем разделе, определяет взаимное пространственное расположение мутаций на генетической карте, Комплементацнонный тест, с другой стороны, определяет функциональные отношения мутантов, Все гП-мутанты обладают одинаковым фенотипом (табл. 6.!). Одинаковы ли их генетические функции? Для ответа на этот вопрос клетки Е. сой К(Х) заражали различными парными комбинациями мутантов гП, как это схематически изображено на рис. 6.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
