Айала, Кайгер - Современная генетика - т.1 (947304), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Только постепенно ученые осознали, что механизмы наследования признаков у человека и бактерий в основах своих имеют очень много общего. Экспериментальные исследования бактериофагов Исследовании, проведенные иа фатах, внесли неоценимый вклад в наше понимание механизмов наследственности. Заражая бактериальные культуры, легко получить колоссальные популяции фагов-до !Оы часзиц в 1 мл и более. Титр фагов в культуре определяется следующим образом.
Суспензия фаговых частиц соответствующим образом разводится, смешивается с определенным объемом культуры живых бактериальных клеток в полужидком агаре, а затем эта смесь равномерно распределяется по поверхности твердой питательной среды в чашке Петри и затвердевает. После инкубации живые бактерии, размножаясь, образуют плотный и видимый невооруженным глазом сплошной слой клеток (газон).
В тех же местах, которые инфицированы фаговыми частицами, образуются негативные колонии (или бляшки) (рис. 4.2). Пробы, взятые из этих бляшек, способны заражать бактврии в других чашках потомством исходного фага. Если фаговых частиц в бактериальной культуре относительно мало, то каждая негативная колония на бактериальном газоне содержит потомство одной индивидуальной частицы фага. Концентра- <'нажав бангарна.анан нгаатзтаа 1О нан с ажнгннн и нн гатснанан Рис. 42.
Для определения количества жиз- неспособных фаговых частиц образец препа- рата последовательно разводят и фиксиро- ванный объем разбавленной феновой куль- туры смешивают с определенным объемом полужидкого питательного агара, содсржаше- го несколько капель свежей бактериальной культуры )примерно 10' клеток). Затем полу- жидкий агар, смешанный с бактериями и фа- аами, выливают на поверхность твердой среды в чагпку Петри, где он и застываег. После инкубации бактерии образуют на по- верхности чашки плотный газон.
В тех ме- стах, где заражение фаном вызвало ливис бактерий, в газоне образуются ндыркин. Число «дырокн, или бляшек, отражает число частиц фага, попавших в полужидкий а!ар. Если на поверхности чашки насчитывается 100 бляшек, значит, в 0,1 мл разбавленной культуры содержалось 100 фааовых частиц.
Число фатов в исходной культуре, следова- тельно, было равно (100 фагов10.! мл) 10' 10' 1О' 1О' = 1О" фа- нов в 1 мл. !Бает гь Я., Са)нла)аг К. 1978. Мо)есп1аг ГЗспейсн, 2па) еа)., Ж.Н. Егеспаап, Бап Ргапс)нсо.) [Имеется перевод: С'гнннгн Г., Кзлнндар Р. 1981. Молекулярная генетика, М., Мир.З 4. Природа генетического материала 93 цию (титр) фага в исходной культуре можно определить, подсчитав число бляшек на газоне и умножив его на коэффициент разведения, как это показано на рис.
4.2. Заражая свежую культуру бактерий материалом из одной негативной колонии, можно получить чистый препарат фага, ДНК вЂ” трансформирующий фактор пневмококка В наши дни общеизвестно, что дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) -носитель наследственности у всех прокариот и эукариот. Впервые это было показано в исследованиях на бактериях пневмококках. Некоторые линии (штаммы) этого микроорганизма вызывают воспаление легких у млекопитающих. Бактерии патогенных штаммов синтезируют полисахаридную капсулу, слизистая поверхность которой защищает бактериальную клетку от фагоцитов иммунной системы зараженного животного.
Штаммы пневмококков можно отличить друг от друга по анэ.ителам, продуцируемым животными в ответ на попадание в их организм различных полисахаридов и белков соответствующей линии бактерий. Именно по аптителам на капсулярные полисахаридгк различают патогенные штаммы; их обозначают как тип 1, тип П, тип П1 и т.д. Патогенные штаммы, выращиваемые на твердой питательной среде в лаборатории, образуют блестящие гдадкие колонии; такую морфологию колонии имеют из-за синтезируемых бактериями слизистых оболочек. Иногда возникают мутантные клетки, утратившие способность к ферментативной активности, необходимой для синтеза слизистой оболочки. Эти мутантные клетки образуют колонии с шероховатой поверхностью; они в отличие от родительских клеток Я обозначаются буквой К (рис.
43). К-штаммы размножаются так же успешно, как и штаммы Я, причем иногда происходят обратные мутации, восстанавливающие способность к синтезу слизистой оболочки. Тип капсулярных полисахаридов, синтезируемых в ревертантах, всегда совпадает с типом полисахаридов исходного родительского штамма: ПЯ ПК, П1Я ~ П)К и т.д. Следовательно, различные К-штаммы нетождественны: каждый из них соответствует родительскому штамму б. Рис. 43. Колонии аневмококков, растущие на питательной среде. Маленькие колонии принадлежат бактериям типа 11К, а большие блестящие колонии - трансформированному типу ГГГК (Ргог.
Маг)ул МсСаггу, Косхге(!ег Пшвегпгу.) Организация и передача генетического мапьериаяа Бактерии К-штаммов непатогенньь Когда такие клетки попадают в организм животного, например мыши, то такая мышь обычно переносит заражение, вырабатывая антитела, ведущие к фагоцитозу и гибели бактериальных клеток. Однако мышь, зараженная бактериями 8-штамма, неизбежно гибнет от воспаления легких, поскольку эти бактерии покрыты синтезируемой ими слизистой оболочкой.
В 1928 г. Фредерик Гриффит показал, что если мьппи ввести пневмококки штамма ПК вместе с убитыми нагреванием клетками типа И18, то мыши погибают от инфекции, которая, как показывает вскрытие, вызывается клетками типа П1$. Контрольные эксперименты показали, что порознь ни инъекция клеток ИК, ни инъекция убитых нагреванием клеток И18 не ведет к гибели мышей. Тот факт, что вызывающие инфекцию клетки синтезировали слизистую оболочку типа И1, а не типа И, свидетельствовал о том, что эти клетки не могли возникнуть в результате обратной мутации в клетках штамма ПК (ИК ПЬ).
Гриффит пришел к заключению, что непатогенные клетки штамма ПК могут трансформироваться в патогенные убитыми нагреванием клетками штамма П1$. Оказалось, что слишком высокая температура разрушает трансформирующий фактор, а слишком низкая температура не нарушает активность фермента, разрушающего трансформирующий фактор, и, следовательно, тоже подавляет трансформацию.
Было показано, что при температуре 65"О уже прекращается ферментативная активность, но еще сохраняется активность трансформирующего фактора. Впоследствии другие исследователи обнаружили, что трансформация непатогениых штаммов пневмококка в патогенные может осуществляться и в лабораторной культуре клеток. Изредка возникающие трансформированные клетки легко отделить от нетрансформированных, поскольку они не агглютинируются сывороткой, содержащей антитела против клеток типа ПК. Агглютинировавшие клетки ПК осаждаются хлопьями на дно культурального сосуда, тогда каь трансформированные клетки не слипаются, а свободно размножаются, образуя мутную суспензию клеток И18 (рис.
4.4). Развитие такого метода выделения трансформированных клеток (п чйго (ив пробирке») дало важное преимущество, поскольку позволило исследовать природу трансформирующего фактора убитых нагреванием клеток И18 непосредственно, не вводя их мышам и не дожидаясь гибели последних. Освальд Эвери, Колин Мак-Леод и Маклин Мак-Карти использовали этоз метод для определения вещества, ответственного за трансформирующую активность убитых нагреванием клеток И1Я. Результаты их исследований, опубликованные в 1944 г,, показали, что трансформирующим фактором служит дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Когда в растущую культуру клеток ИК добавляли очищенную ДНК пневмококка !ПБ, этого оказывалось достаточно дпя того, чтобы у некоторых клеток типа ПК возникла способность синтезировать капсулярный полисахарид, характерный для клеток типа И1К Затем Эвери и езо соавторы показали, что трансформирующий фактор может быть разрушен ферментами, расщепляющими ДНК (дезоксирибонуклеазами).
Из этих экспериментов также следовало, что клетки типа ПК, полученные в результате вызванной ДНК трансформации из клеток П18, могут передавать приобретенную способность к биосинтезу определенного полисахарида своему потомству. Таким образом, зто новое свойство, полученное вместе с ДНК дру- 4. Природа генетического материала 95 условия эксперименте К етки линии Ц!З Полисзхзриды, К н раль онтраль битые экстрзгировзннме убиты из клеток ппзммз нзгревышем и!3 Белки, экстрзгировзниые из клеток штамма !ИЗ ДНК иэ клеток ппзммв П!3 ь ДНКззз ДНК из клеток штамма и!З трзнсформировзнные бактерии с нолисзхврипиай оболочкой пинии П!3 не згглюпгиируют и продолжают размножаться, вызывз» помутнение среды Рис. 4.4.
Постановка эксперимента по апре- при фракдиониравании содержимого клетки. делению природы трансформирующего аген- Оказалось, что трансформирующим фактота Активный фактор, содержапэийсл ром является вязкая иативиая ДНК пневмов убитых высокой температурой клетках кокка. 1ПБ, может быть выделен в чистом виде Клетки штамма Пх згглютиннруются сыворопсой и осзждзются нз дио пробирки той линии клеток, становится наследственным свойством трансформированной клетки, как до того оно было наследственным свойством линии, из которой была получена ДНК. Следует подчеркнуть, что химический состав ДНК совершенно отличен от полисахарида, образующего слизистую оболочку, синтезируемую клетками линии 111б; зто означает, что трансформирующий фактор не является полнсахарндом, влияющим на фенотипическое проявление слизистой оболочки.
Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти впервые показали, что наследственная способность клетки осуществлять определенную биосинтетическую функцию может передаваться другой клетке вместе с очищенной ДНК, Это открытие можно назвать выдающимся. В дальнейших исследованиях механизма трансформации было продемонстрировано, что фрагменты ДНК !в том числе содержащие ген, ответственный за синтез полнсахарида) из убитых высокой температурой клеток попадают в к-клетки и посредством рекомбинации включаются в их ДНК !рис. 4.5). Фундаментальное значение этого открытия, однако, не было вполне оценено сразу по трем причинам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
