kursovik (677434), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

люцигенина.

Предложено много методов регист­рации ХЛ фагоцитарных клеток, эти методы можно разделить на 2 основных класса.

/. Регистрация собственной ХЛ. Усиление собственной ХЛ фагоцити­рующих клеток наблюдается при сти­муляции опсонизированным зимоза­ном, бактериями, частицами латекса. Собственная ХЛ клеток имеет низкую интенсивность и лежит в ши­роком спектральном диапазоне с мак­симумом в области 400—500 нм. Регистрация ХЛ требует высокий чув­ствительности прибора и достаточного количества выделения клеток (обыч­но не менее 10⁶ клеток). Эритроциты, гемоглобин, сыворотка крови ингибируют ХЛ.

2. ХЛ в присутствии люминола. Свечение имеет на 2— 3 порядка большую интенсивность, чем собственная ХЛ. Усиление ХЛ на­блюдается при действии зимозана, бактерий, частиц латекса, комплексов антиген — антитело, ионофора каль­ция, хемотаксических пептидов. ХЛ может наблюдаться в суспензии как выделенных, клеток, так и клеток в сыворотке крови.

Таким образом, хемилюминесцентный метод позволяет проводить быст­рую количественную оценку фагоци­тарной и бактерицидной активности клеток. Он может использоваться при исследовании малых количеств биоло­гического материала крови, или может служить как для оценки состояния клеток, так и для оценки опсонической активности сыворотки и влияния лекарственных препаратов.

1. Наиболее точными и быстрыми мето­дами определения фагоцитарной актив­ности лейкоцитов являются радиометри­ческие. Так, поглотительную способ­ность оценивают по уровню включения изотопа в фагоцитирующие клетки. Для этого используют меченные Сr эритро­циты, радиоактивную масляную эмульсию или микробы, меченные ¹⁴С-глицином, ³Н-лейцином, ³Н-уридином, или частицы ¹⁹²Ir. Иногда фагоцитоз оценивают по умень­шению метки (³²Р) во внеклеточной сре­де.

Радиометрические методы отличаются быстротой постановки и объективностью оценки результатов. Как правило, в конце инкубации микробов с фагоцита­ми последние разрушают осмотическим лизисом, замораживанием — оттаива­нием или дезоксихолатом натрия, затем добавляют на 30 мин при 37°С ³Н-тимидин и подсчитывают радиоактивность осажденных на фильтре бактерий. С помощью двойной метки определяют одновременно поглотительную и бакте­рицидную функцию лейкоцитов. Для этого предварительно метят микро­бы одним из изотопов (¹⁴С-фенилаланин, ¹⁴С-ацетат натрия), а затем в конце ин­кубации разрушают фагоциты и вносят ³Н-тимидин. Радиоактивность первона­чально меченых микробов, включенных в фагоциты, будет отражать их погло­тительную функцию, а радиоактивность, включенная в микробы, после разруше­ния фагоцитов будет характеризовать их бактерицидность. Существуют авто­радиографические методы оценки завер­шенности фагоцитоза по включению изотопа в процессе инкубации на стек­лах монослоя фагоцитов с микробами.

1. Одним из по­казателей функциональной активности макрофагов является уровень актив­ности 5’-нуклеотидазы. Активность данного фермента определяют в суспензии не разрушенных МФ по методу Туманян и Кириличевой. Метод отличается простотой и точностью, достоверностью, достаточно часто используется.

III.Некоторые моделируемые процессы.

СНИЖЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕИ В УСЛОВИЯХ СОЧЕТАННОГО ПРИ­МЕНЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОГО

ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА А И ЭНДОТОКСИНА

Механизмы патогенного действия стафилококко­вых энтеротоксинов (СЭ) изучены недостаточно. Известно, что блокада ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) торотрастом повышает чувстви­тельность животных к рвоте, индуцированной СЭ. Это предполагает, что функциональный статус РЭС играет важную роль в ответе орга­низма на энтеротоксин. Данные литературы сви­детельствуют и о возможности влияния СЭ на функционирование фагоцитирующих клеток. Во-первых, введение СЭ обезьянам через желудоч­ный зонд приводит к развитию острого гастро­энтерита с экссудацией нейтрофилов, макрофа­гов и другими признаками воспаления. Во-вторых, важнейшим свойством СЭ является спо­собность сенсибилизировать животных к ле­тальному действию эндотоксинов грамотрицательных бактерий (липополисахарид — ЛПС), что ставит их в один ряд с веществами, вызыва­ющими гиперактивацию РЭС, и также оказыва­ющими сенсибилизирующее действие. При­нимая во внимание постоянный контакт орга­низма с условно-патогенными бактериями, а со­ответственно и с эндотоксинами кишечной мик­рофлоры, исследование макрофагальных функ­ций, ответственных за элиминацию микроорга­низмов в условиях воздействия СЭ и при соче­танием применении их с ЛПС, приобретает осо­бую актуальность. В связи с этим, задачей опыта явилось изучение основных за­кономерностей изменения фагоцитарной и бакте­рицидной функций макрофагов под действием СЭ типа А (СЭА) и ЛПС.

I серию опытов по изучению фагоцитарной и бактери­цидной активности проводили с макрофагами, полученными от мышей следующих групп: 1-я — через 2 ч после инъекции энтеротоксина, 2-я и 3-я — через 24 ч после введения СЭА и ЛПС в отдельности, 4-я — через 24 ч после введения эндотоксина на фоне СЭА. СЭА вызывал двукратное снижение общего числа клеток уже через 2 ч после инъекции; через 24 ч общее количество клеток по-прежне­му оставалось пониженным. Если ЛПС у интактных мышей способствовал увеличению выхода клеток в брюшную полость, то на фоне СЭА их количество не только не возрастало под действием ЛПС, а даже достоверно уменьша­лось по сравнению с контролем.

Изучение фагоцитарной и бактерицидной ак­тивности макрофагов через 2 ч после введения мышам СЭА выявило их заметное снижение по сравнению с показателями для контрольных жи­вотных. Через 24 ч после инъекции СЭА и ЛПС в отдельности наблюдалось усиле­ние фагоцитоза. Выявленные закономер­ности изменения фагоцитарной функции макро­фагов вполне согласуются с данными литерату­ры, посвященными изучению клиренса угля у кроликов после введения стафилококковых знтеротоксинов. Н. Sugiyama также наблюдал бифазовые изменения фагоцитарной функции РЭС; подавление степени клиренса угля через 2ч после инъекции, сменяющееся его увеличени­ем через сутки.

Бактерицидная активность макрофагов, полу­ченных через 24 ч после обработки животных отдельно СЭА и ЛПС, также возрастала. В случае же совместного введения ука­занных токсинов функция поглощения изменя­лась незначительно, зато степень завершенности фагоцитоза резко снижалась. Необходимо отме­тить, что исследование морфологического соста­ва клеток перитонеального экссудата мышей че­рез 24 ч после инъекции СЭА и ЛПС не выявило существенных различий в процентном соот­ношении макрофагов в опытных группах живот­ных. Поэтому можно утверждать, что выявлен­ные изменения фагоцитарной и бактерицидной функций обусловлены влиянием исследуемых токсинов.

Для уточнения характера влияния СЭА и ЛПС на функциональную активность макрофа­гов следующую серию опытов провели в системе in vitro. С этой целью резидентные перитоне-альные макрофаги, полученные от интактных животных, инкубировали с токсинами в течение 24 ч. В данном случае функция поглощения из­менялась в меньшей степени. Бакте­рицидная активность, также как и в опытах in vivo, повышалась под действием СЭА и ЛПС в отдельности. При одновременном добавлении токсинов к макрофагам бактерицидная функция увеличивалась, а в условиях, приближающихся к таковым in vivo, т. е. при добавлении ЛПС через 4 ч после СЭА, способность макрофагов убивать Staph. aureus также резко снижалась.

Таким образом, в условиях сочетанного при­менения СЭА и ЛПС происходит резкое сниже­ние функции завершенного фагоцитоза макрофа­гов. Тот факт, что в условиях in vitro прослежи­ваются те же закономерности, что и в системе in vivo, предполагает, что СЭ оказывает непо­средственное действие на макрофагальные функ­ции. Учитывая, что фагоцитирующие клетки представляют собой первую линию защиты от чрезвычайно распространенных условно-пато­генных микробов, снижение бактерицидных свойств в условиях синергического действия СЭ с эндотоксинами грамотрицательных бактерий в организме может привести к развитию тяже­лых септических осложнений.

ОТМЕНА УСИЛИВАЮЩЕГО ФАГОЦИТОЗ ДЕЙСТВИЯ ОПСОНИНОВ С ПОМОЩЬЮ

ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ ПРОТИВ Fc-РЕЦЕПТОРОВ МАКРОФАГОВ

Один из наиболее важных и давно установ­ленных иммунологических феноменов — усиление захвата фагоцитирующими клетками корпуску­лярных антигенов после их сенсибилизации IgG-антителами — оставался продолжительное время малоизученным. После выяснения принципов структурной организации молекулы IgG и об­наружения на поверхности фагоцитов и в том числе макрофагов рецепторов для Fc-участка IgG было постулировано, что опсонизирующие антитела обеспечивают усиление за­хвата корпускулярного антигена благодаря вза­имодействию Fc-участка молекулы антитела с Fc-рецептором (FcR) макрофага. Единст­венным экспериментальным доказательством в пользу этого был факт отсутствия у Fab-фрагментов опсонизирующих антител способно­сти усиливать захват корпускулярного антигена доказательства вовлечения FcR в процесс захва­та опсонизированного корпускулярного антигена. Подобный экспериментальный подход нель­зя рассматривать как адекватный для прямого доказательства вовлечения FcR в процесс захва­та опсонизированного корпускулярного антигена. Исходя из сказанного, было решено получить прямые доказательства роли FcR в реализации механизма усиления захвата макрофагами кор­пускулярного антигена, сенсибилизированного IgG-антителами. Это было достигнуто при оцен­ке влияния на указанный процесс Fab-фрагментов антител против FcR макрофагов, которые, как было установлено, препятствуют взаимодействию с макрофагами агрегированного IgG. Пре-инкубация перитонеальных макрофагов с Fab-фрагментами анти-FcR-антител полностью отме­няла эффект усиления захвата макрофагами оп­сонизированного антигена.

В результате опыта было установлено, что Fab-фрагмент IgG из анти-FcR-сыворотки эффективно блокирует FcR мышиных мак­рофагов, препятствуя связыванию этими клетка­ми гетерологичного агрегированного IgG. Эти данные хорошо согласуются с фактом блокиро­вания FcR перитонеальных макрофагов бивалентными FаЬ-фрагментами из антиFcR. Эти данные в сочетании с результатами контрольных экспериментов, свидетельствующи­ми об отсутствии способности блокировать FcR Fab-фрагментами IgG из антисыворотки против иммунного преципитата, указывают на возмож­ность использования моновалентных Fab-фраг-ментов aнти-FcR-aнтитeл для изучения функции FcR макрофагов в реализации действия опсонинов. Следует подчеркнуть, что использование моновалентных фрагментов анти-FcR-антител имеет принципиальное значение при изучении функциональной роли FcR, поскольку в отличие от нерасщепленных антител или бивалентных FаЬ-фрагментов моновалентные Fab-фраг­менты неспособны, связавшись с FcR, вызвать при 37 °С их латеральное перемещение по цитоплазматической мембране и последующий кэппинг.

Полученные данные свидетель­ствуют, что преинкубация макрофагов с Fab-фрагментами aнти-FcR-антител полностью отме­няет эффект усиления фагоцитоза S.typhimurium(взятую как объект проверки эффективности фагоцитоза), обусловленный IgG-антителами кролика против этого микроорганизма. Собственно Fab-фраг­менты aнти-FcR-антител не оказывают какого-либо влияния на фагоцитоз несенсибилизирован­ных антителами бактерий. Если к макрофагам предварительно добавляли Fab-фрагменты ан­тител кролика против иммунного преципитата, образованного яичным альбумином и IgG-анти­телами кролика против этого антигена, это не оказывало никакого влияния на процесс фагоци­тоза сенсибилизированных антителами бакте­риальных клеток.

Таким образом, Fab-фрагменты анти-FcR-aнтител избирательно подавляют фагоцитоз толь­ко сенсибилизированных антителами бактерий. С учетом результатов контрольных эксперимен­тов это служит несомненным доказательством в пользу того, что усиление захвата корпускуляр­ного антигена после его опсонизации IgG-анти­телами обусловленно взаимодействием Fc-уча-стка опсонизирующих антител с FcR макрофа­гов.

Обращает на себя внимание тот факт, что мак­рофаги, предварительно обработанные Fab-фрагментами aнти-FcR-антител, менее эффек­тивно поглощают сенсибилизированные антите­лами бактериальные клетки, чем несенсибилизи­рованные. Этот результат можно объяснить, исходя из представления, что после сенсибилизации бактерий у части из них проис­ходит стерическое экранирование участка кле­точной поверхности, посредством которого мик­роорганизмы прикрепляются к макрофагам. Фа­гоцитоз таких бактериальных клеток осуществ­ляется, по-видимому, после взаимодействия двух молекул антител или более через их Fс-участки с несколькими FcR на цитоплазматической мем­бране макрофага. Если указанное предположе­ние справедливо, захват этой части сенсибили­зированных бактериальных клеток будет невоз­можен после блокирования FcR с помощью Fab-фрагментов aнти-FcR-антител.

Полученные в настоящей работе данные от­крывают новые подходы для регуляции процес­са иммунного фагоцитоза, что может иметь су­щественное значение для детального анализа роли этого процесса при различных патологиче­ских состояниях.

Характеристики

Список файлов реферата