kursovik (677434), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Активированные МФ подавляют пролифера­цию нормальных и опухолевых сингенных, алло-генных и ксеногенных клеток — быстро пролиферирующих сильнее, чем медленно пролиферирующих. Однако быстро пролиферирующие опу­холевые клетки полностью подавляются, тогда как нормальные клетки — лишь частично.

Механизм цитотоксичности МФ сложен. Специ­фический армирующий фактор с молекулярной массой 25000—50000 дальтон имеет аффинность к АГ опухоли, связывается с поверхностью МФ, секретируется коммитированными Т-лимфоцитами. Важен межклеточный контакт мишени и МФ, который постоянно возникает, причем зона кон­такта имеет 100—200А. Предполагают, что он может способствовать локальному слиянию и инъецированию в мишень лизосом МФ, лизирующих ее. По разным данным, киллинг может осуществляться сериновыми протеазами, возникающим под влиянием лизосомальных гидролаз СЗа-субкомпонентом комплемента, катионным белком или индукцией макрофагами в мишенях аберрантного деления, приводящего к их лизису. Вместе с тем считают, что роль простагландинов, аргиназы, перекиси водорода и интерферона не столь существенна в непосредственном цитолитическом эффекте.

Определенное значение придают изменению структуры мембран эффекторов и мишеней, так как обработка МФ фосфолипазой или лизолецитином индуцирует в них противоопухолевую ци­тотоксичность, что объяснили возможным обра­зованием на мембране цитолитической структу­ры в результате изменения ее конформации. Подобные процессы, по-видимому, происходят при активации МФ липополисахаридами (ЛПС), в результате которой ЛПС через липид А связы­вается с плазматической мембраной М.Ф, изменяя ее организацию в результате формирования комплекса липид А — мембранный липид, по этой же причине, возможно, тумороцидная способность МФ резко подавлялась после их экс­позиции с липопротеидами низкой плотности или холестериновыми липосомами.

В организме в силу посто­янного выделения бактериальных эндотоксинов, иммунологических реакций различной специфич­ности, сопровождающихся освобождением лимфокинов, образованием иммунных комплексов, по­стоянно поддерживается популяция неспецифи­чески активированных МФ, выполняющих надзор за спонтанно появляющимися трансформирован­ными клетками и элиминирующими их.

МФ имеют огромное значении системы мононуклеарных фагоци­тов в естественной устойчивости организма к опухолям. Поскольку подавление пролиферации макрофагами не зависит от вида и типа клеток, характеристики роста, трансформации и реактив­ности, это свидетельствует о наличии у МФ структур узнавания, не имеющих иммунологической специфичности. В мишенях появляются общие изменения, узнавае­мые вездесущими МФ, которые поэтому являют­ся широкими регуляторами общего клеточного гомеостаза.

За 120 лет, прошедшие со дня создания И. И. Мечниковым уче­ния о фагоцитах, оно ушло далеко вперед. Роль МФ оказалась неизмеримо более широкой и вы­шла за рамки иммунологии.

Эта теория оказала глубочайшее конструктивное влияние на все развитие современной иммунологии. Именно она послужила началом изучения клеточных аспектов иммунитета. Некоторые аспекты теории, предсказанные И. И. Мечниковым, до сих пор остаются недостаточно разработанными. Очевид­но, что научное наследие, оставляемое нам И. И. Мечниковым, и в будущем будет опреде­лять основные направления учения о фагоцитах.

Макрофаги перитонеального экссудата как модель фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности.

В организме человека фагоцитирующую функцию выполняют несколько типов клеток. Прежде всего, это те клетки, которые осуществляют защиту при каких-либо инфекциях и инвазиях – макрофаги, моноциты и нейтрофилы. В меньшей степени она представлена у эозинофилов и базофилов. Кроме того, общеизвестным является тот факт, что в различных тканях фагоцитирующую функцию берут на себя (помимо вездесущих макрофагов) специфические клеточные элементы данной ткани, например: фиброкласты, остеокласты, клетки микроглии. Также нельзя забывать о том, что к тем немаловажным клеткам, благодаря которым идет специфический иммунный ответ, относятся дендритные клетки, широко представленные в местах, являющихся барьерными в организме. И хотя их фагоцитирующая функция до конца не доказана, данные о том, что это так, есть.

Существуют различные методы изучения фагоцитирующей активности у клеток, перечисленных выше. В данном реферате будут рассмотрены методы изучения тех фагоцитов, у которых фагоцитирующая функция наиболее выражена и которые представляют исключительную важность в иммунной системе человека, а их патология носит тяжелый характер. Речь идет о макрофагах (МФ). Они хорошо поддаются изучению in vivo и in vitro, культивированию; моделирование различных процессов на этих клетках получило широкое распространение и дало хорошие результаты. Это обусловлено их крупными размерами, широчайшей распространенностью в организме, активностью метаболических процессов, протекающих в них, разнообразием функций, на них возложенных.

В качестве модели, хорошо себя зарекомендовавшей и наиболее часто используемой в опытах по изучению фагоцитов, можно рассмотреть модель перитонеальных макрофагов in vitro. Широкое распространение данная модель получила по нескольким причинам. Во-первых, она легко воспроизводится. Во-вторых, она позволяет легко регистрировать результаты исследований. В-третьих, данную модель можно получить как у лабораторных животных (крысы, мыши, морские свинки), так и у человека. В-четвертых, при проведении опытов на животных можно использовать различные линии животных (в т.ч. нокаут-животных) и животных с приобретенными (искусственно вызываемыми) дефектами иммунитета. В-пятых, при постановке опытов можно индуцировать септическое и асептическое воспаление, можно перед взятием клеток провести различные воздействия, а на модели лишь зарегистрировать результаты (т.е. сама реакция проходит in vivo).

Можно приводить также и другие причины, но ограничимся этими. Естественно, эта модель не является единственной, предложены и другие, о которых будет упомянуто ниже.

Итак, рассмотрение выбранной модели будет происходить следующим образом:

1. Варианты получения модели.

2. Возможные методы регистрации результатов исследования.

3. Различные варианты моделируемых процессов.

Вопросы, касающиеся практического аспекта использования результатов исследования, будут рассматриваться в каждом случае, а не будут выносится в отдельный раздел.

I.Получение модели.

Опыты проводят на белых мышах, крысах, морских свинках (в редких случаях на кроликах) различных линий (CC57/W, CBA, «WISTAR», C57BL/6), а также на нелинейных животных. Выделяют индуцированные и неиндуцированные МФ. В случае, если необходимы интактные МФ, то животным вводят интраперитонеально стерильный 10% раствор пептона или несколько мл стерильного парафинового масла, можно также использовать 2,5% раствор крахмала в физ. растворе. Обычно, через 48 часов наркотизированное животное забивают, перитонеальную полость промывают и перитонеальную жидкость отсасывают. В полученную жидкость добавляют стабилизатор (гепарин, глютатион) и антибиотики (но только не макролидового ряда!), чаще используют пенициллин, стрептомицин. Далее жидкость можно центрифугировать и последующей выдержкой, а можно сразу выдерживать в стеклянных кюветах (2 ч). Основной принцип состоит в том, что макрофаги обладают способностью прикрепляться к стеклу или пластику, тогда как другие клетки этой способностью не обладают. После экспозиции саму среду сливают (или промывают) и готовят новую, не содержащую гепарин. Полученная таким образом популяция клеток считается, что состоит на 95% из МФ. Далее клетки помещают на специальные среды (N199) с питательными веществами и антибиотиками. Сохраняться такие МФ могут не более 48-72 часов при поддержании оптимальной температуры (37 С) и ионно-осмотического баланса.

В случае, ежели необходимы активированные МФ, то их активацию проводят путем

• Иммунизации животного введением различных сывороток или мощных антигенов,

• Индуцированием очага септического воспаления брюшины (введение токсина в р-ре пептона, введение взвеси убитых или живых микроорганизмов).

Дальнейшие действия совпадают с уже названными.

Представляет интерес также выделение человеческих МФ. Обычно, их получают из асцитической жидкости больных с недостаточностью кровообращения III степени. Затем их осаждают центрифугированием (400g, 10 мин), замораживают при температуре жидкого азота. После размораживания их помещают в специальные чашки со средой и культивируют.

Подчас непосредственно МФ полученные из перитонеального экссудата служат лишь для регистрации опыта поставленного над животным in vivo и их культивирование носит только диагностических характер.

II.Регистрация результатов

После постановки опытов возникает резонный вопрос, а как обнаружить изменение активности МФ, как определить те изменения, повлиявшие на работу фагоцитирующих клеток. В нашей стране наиболее широко используется несколько методов.

1. Для исследования поглотительной фазы фагоцитоза используют различные тест-объекты. Ими могут служить кроме микробов эритроциты и различные индиф­ферентные частицы: латекса, туши, кармина, коллоидного угля, кадмия. Поглотительную активность фаго­цитов оценивают прямым визуальным подсчетом поглощенных микробов или других частиц внутри МФ, а так­же по числу частиц, оставшихся непо­глощенными, например частиц латекса, с помощью электронного счетчика ча­стиц, эритроцитов по концентрации гемоглобина спектрофотометрически, эмульгированных частиц масляного красного со спектрометрической регистрацией или меченных флюоресцеинизотиоцианатом микрококков с по­мощью флюориметра. Высокая точ­ность и производительность характери­зуют метод изучения фагоцитоза флюо­ресцирующих частиц латекса с помощью автоматического проточного цитофлюо-риметра. При использовании прямого визуального метода рассчитывают фагоцитарный ин­декс (ФИ) — процент фагоцитирую­щих клеток от общего числа, фагоци­тарное число (ФЧ) — среднее ко­личество частиц, захваченных одной клеткой. Отдельно учитывают резуль­таты через 1 и 3 ч: соответственно ФИ1, ФИ3, ФЧ1 и ФЧ3 , а также коэф­фициент фагоцитарного числа (КФЧ): отношение ФЧ1 к ФЧ3 — показатель, характеризующий скорость фагоцитоза.

Необходимо помнить, что эффективность всех этих показателей зависит от ряда условий, таких как длительность инкубации, формы дна сосуда — круглой и ко­нической (в конических пробирках наблюдались более высокие показатели фагоцитоза, что, видимо, обусловлено стимулирующим влиянием короткодистанционного взаимодействия), pH среды, содержания кислорода и углекислоты.

1. Оценка хемотаксиса лейко­цитов осуществляется двумя распро­страненными методами. Метод Бойдена основан на принципе прохождения лей­коцитов из одной половины камеры со взвесью клеток в другую половину с хемоатрактантом, разделенных между собой мембранным фильтром. Для изучения хемотаксиса макрофагов применяют фильтры с раз­мером пор соответственно 5— 8 мкм. Имеющиеся разновидности мето­да Бойдена включают двухфильтровый и радиоизотопный варианты. Другой метод основан на хемотаксисе под слоем агарозы. В качестве хемоатрактанта чаще используют обра­ботанную зимозаном или липополисахаридом сыворотку, казеин, фильтрат культуры Е. coli или других микроорга­низмов, синтетические формилпептиды.

Движение клеток при отсутствии хемотаксического стимула дает характери­стику

случайной двигательной активности (спонтанная миграция) фагоцитов.

Измерение эластичности клеток также можно осуществить в камерах Бойдена.

Адгезивные свойства фагоцитов оценивают по прилипаемости на поверхности стекла

или в колон­ках с бусами. Между способностью к распластыванию макрофагов, оп­-

ределяемой под фазово-контрастным микроскопом, и фагоцитозом имеется

определенная корреляция

1. Для оценки уровня активности МФ используется полярографический метод (потребление кислорода), НСТ-тест (восстановление нитросинего тетразолия), йодирование (пере­ход радиоактивного меченого йода в кислотонерастворимый осадок), окис­ление глюкозы (образование молекул ¹⁴СО₂ при окислении глюкозы-1-¹⁴С). Данные тесты основаны на том, что активация МФ сопровождается кислородзависимым метаболическим «взрывом». Классическим из данных методов стал НТС-тест. Дело в том, что активированные фагоциты способны поглощать нитросиний тетразолий (НСТ) и восста­навливать его в формазан. НСТ-тест позволяет дифференцировать активированные и интактные фагоциты, но его нельзя считать количественным, так как визуальная оценка результатов субъективна

2. Также для определения бактерицидной способности МФ используется хемолюминесцентный метод, предложенный сравнительно недавно. Как известно, фагоцитоз нейтрофилами и мак­рофагами сопровождается генерацией активных форм кислорода (О₂-, Н₂О₂, ОН^-), индуци­рующих явление хемилюминесценции. По­следняя пропорциональна интенсивности генера­ции фагоцитами активных форм кислорода и может служить косвенным критерием их фагоци­тарной способности, тем более что образуемые продукты обладают выраженными бактерицидны­ми свойствами. Метод анализа хемилюмине­сценции используется в клинике и эксперименте.

Среди методов регистрация хемилюминесценции (ХЛ) является наиболее чувствительным и информа­тивным методом функциональной оценки фагоцитирующих клеток, но вместе с тем и одним из наиболее сложных, не столько в методическом плане, сколько в понимании природы биохимических и физических процес­сов, которые приводят к излучению света. Механизмы, лежащие в основе ХЛ фагоцитов, сложны и недостаточно изучены. Свечение может возникать в реакции O₂+O₁=2O₂+hV, важ­ную роль могут играть радикалы ОН-. Анализ различных ингибиторов свечения приводит к мысли, что синглетный кислород, гидроксильный ра­дикал и перекись водорода вовлечены в процесс ХЛ.

ХЛ фагоцитирующих клеток значи­тельно усиливается в присутствии лю­минола или

Характеристики

Список файлов реферата