kursovik (677434), страница 6

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 6)

УСИЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ХИТОЗАНА РЕАКЦИИ КОНТАКТНОГО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРОФАГА С ТИМОЦИТАМИ in vitro

Старая и многогранная проблема иммуностимуляции приобрела новое выражение в связи с поиском путей к созданию искусственных вак­цин. Основные усилия в данном направлении связаны с получением конъюгатов вакцинирую­щих антигенных детерминант с природными или искусственно синтезированными полимерными носителями. Роль носителя в таком молекуляр­ном комплексе должна состоять в усилении специфического ответа на избранную антиген­ную детерминанту.

При поиске эффективного носителя, который мог бы быть использован при конъюгации с ан­тигеном, необходимо иметь сведения о его адъювантном эффекте и отсутствии побочных пато­генетических свойств. В этой связи было обращено внимание на хитозан — гомополисахарид, вы­деляемый из хитина наружного скелета беспоз­воночных. Молекулярная масса изучаемого ве­щества ~ 120000 дальтон.

Цель исследования — выяснить влияние хитозана на процесс контактного взаимодействия макрофага с тимоцитами в опытах in vitro. Об­ращение к данным клеточным типам не случай­но. Известно, что взаимодействие макрофага с тимоцитами является дополнительным фактором трансформации недифференцированных тимусзависимых клеток в зрелые Т-лимфоциты. В связи с этим интересно определить, оказывает ли какое-либо влияние избранный гомополимер на один из самых ранних этапов становления иммунной системы — формирование функцио­нально активной популяции зрелых Т-клеток.

Было проведено 3 серии опытов. В 1-й серии изучали характер взаимодействия сингенных тимоцитов с прили­пающими клетками перитонеального экссудата, которые инкубировали непосредственно перед постановкой реакции с одной из выбранных доз хитозана в течение различного времени. Уста­новлено, что наиболее эффективно реакция гроздеобразования проходит при 30-минутной инку­бации макрофагов с хитозаном. Коли­чество тимоцитов, группирующихся вокруг мак­рофага, в 2,5 раза больше по сравнению с тако­вым в контроле. В этой же серии опытов решал­ся вопрос об интенсивности взаимодействия ана­лизируемых типов клеток в зависимости от до­зы, использованного для инкубации хитозана, при оптимальном времени инкубации 30 мин. Выяснено, что наибольшее усиление реакции гроздеобразования наблюдается при добавлении в культуру 50 мкг полисахарида.

Во 2-й серии опытов анализ реакции грозде­образования проведен в условиях предваритель­ной 30- и 60-минутной инкубации тимоцитов с разными дозами хитозана. Инкубация в течение как 30, так и 60 мин приводила к усилению контактного вза­имодействия тимоцитов с макрофагами. Как и в предыдущей серии опытов, оптимальная доза, усиливавшая эффект гроздеобразования, равня­лась 50 мкг.

В заключительной 3-й серии опытов проведе­но изучение интенсивности гроздеобразования при внесении хитозана непосредственно в реаги­рующую систему макрофаг—лимфоцит. Как и в 2 предыдущих сериях опытов, констатирова­но усиление контактного взаимодействия ти­моцитов с макрофагами.

Для объяснения выявленных фактов необхо­димо иметь в виду, что хитозан является поли­катионом. В то же время интегральный заряд как тимоцитов, так и макрофагов отрицатель­ный. Возможно, эффект усиления контактного взаимодействия связан с электростатическими межклеточными притяжениями под влиянием хитозана, включающими 2 этапа: 1-й этап — ад-гезия положительно заряженного хитозана на макрофаге или тимоците, 2-й — непосредственное взаимодействие отрицательно заряженной клет­ки с клеткой-партнером, проинкубированной с поликатионом и несущей в результате этого больший положительный заряд. Подобное пред­ставление подкрепляется тем, что эффект усиле­ния реакции гроздеобразования не связан со схемой инкубации и будет одинаков независимо от того, какой тип клеток подвергался инкуба­ции с хитозаном.

Второй момент, который требует объясне­ния, — это незначительное время инкубации кле­ток с хитозаном, при котором обнаруживается эффект усиления контактного взаимодействия. Возможно, что отсутствие эффекта при более длительной инкубации связано с фагоцитозом высокомолекулярного полисахарида, вследствие чего происходит восстановление исходного заря­да взаимодействующих клеток. Однако представ­ленное объяснение должно быть подтверждено дополнительными экспериментальным факта­ми.

АКТИВАЦИЯ ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ

Ряд перспективных неприродных полиэлектро­литов, использующихся для создания синтетиче­ских вакцин, обладает многими иммуномоделирующими потенциями: они усиливают миграцию стволовых клеток, Т- и В-лимфоцитов, являются стимуляторами Т- и В-клеток, замещают хелперную функцию Т-лимфоцитов и макрофагов. Эти свойства обеспечивают сильное стимулирующее действие на реакции гуморального и клеточного иммунитета.

Вместе с тем недостаточно ясным остается во­прос об их действии на систему фагоцитарных клеток, формирование клеточного, в частности трансплантационного, иммунитета. Целью настоя­щей работы было изучение этих вопросов.

Методика исследований была следующей: мышам гибридам(CBAXC57BL/6) внутрибрюшинно вводили различные до­зы полиэлектролитов однократно, выделяли МФ через 48 ч и анализировали их.

Введение полианиона NA-5 вызывает в макрофагах мышей активацию гликолиза. Например, в 3 экспериментах усиление гликолиза по сравне­нию с контрольными клетками было в 1,45, 2,35, 4,3 раза. Это очень сильная активация гликоли­за в клетках, свидетельствующая о переходе их на более высокий физиологический уровень ме­таболизма. Значительно возрастала в клетках и интенсивность гексозомонофосфатного шунта: в 2 из 3 опытов введение полианиона сопровож­далось появлением макрофагов со средней ак­тивностью окисления глюкозы, соответствующей 8,67+1,47 и 7,24+1,95 МФЕ на 10^б клеток (в контроле 5,17+0,95 и 4,1 + 1,29 МФЕ на 10⁶ клеток). Еще более сильной оказалась ин­тенсификация цикла мочевины, различия которо­го по сравнению с контрольными клетками были уже порядковыми. Например, в опытах 1—3 они составляли соответственно 8,43, 11,54 и 2,06 раза.

Существенное усиление гликолиза обусловли­валось также введением животным карбоцепного полиамина Н-З: в 2 из 3 опытов активация была значительной, для ЛДГ она со­ставляла в опытных макрофагах соответственно 89,27+7,41 и 39,54±4,56 МФЕ на 10⁶ клеток, в контрольных — 26,36+8,36 и 20,59+3,86 МФЕ на 10⁶ клеток. Столь же выраженным бы­ло усиление активности окисления глюкозы, ко­торое превышало его в опытных макрофагах в сравнении с контрольными в 3 экспериментах соответственно в 2,11, 1,28 и 1,41 раза.

Крайне значительной была интенсификация цикла мочевины, так как активация ключевого фермента АРГ возрастала в различных опытах в 3,65—54,6 раза..

В то же время активность поликатиона D_11-100э была значительно менее выражена, он не влиял существенно на состояние гликолиза и гексозомонофосфатного шунта макрофагов. Однако все же активность цикла моче­вины в клетках достоверно увеличивалась, хотя и менее существенно, чем под влиянием Н-3 и NA-5.

В макрофагах мышей, стимулированных поли­анионом NA-5, почти двукратно повышалась активность лизосомальных гидролаз, составляя в опыте 27,42+4,09 нМ Р/ч на 10^б клеток и в контроле 15,04+3,66 нМ P/ч на 10^б клеток. Активность КФ после введения мышам Н-3 была еще большей — 35,51+4,82 нМ P/ч на 10^б клеток. Подобное усиление свиде­тельствует о существенном возрастании в макро­фагах переваривающей способности.

У макрофагов мышей полианион NA-5 вызы­вал не только интенсификацию некоторых путей метаболизма, но и повышение экспрессии рецеп­торов к IgG, которое было нерезко выраженным, но статистически достоверным.

Дозозависимым оказался ответ клетки, выявляемый по генерации кислородных радикалов у мышей, которым вводили различные дозы полиамина Н-3. Так, если доза 0,5 мг/мышь подавляла хемилюминесценцию макрофагов при фагоцитозе, не изменяя ее при адгезии клеток на стекло, то дозы 1, 5 и 10 мг/мышь уже обус­ловливали существенное возрастание хемилю-минесценции при фагоцитозе частиц. При адге­зии эти дозы также оказались активирующими, за исключением дозы 5 мг/мышь. Оптимальное усиление генерации активных кислородных ради­калов вызывало введение животным 1 мг/мышь препарата Н-3 — в этом случае повышалась хемилюминесценция максимально и при фагоцито­зе, и при адгезии. Дальнейшее увеличение дозы не сопровождалось повышением действия на клетки. Подобное наблюдение полностью под­тверждается данными литературы о влиянии это­го препарата на различные иммунологические параметры.

Таким образом, синтетические полиэлектроли­ты—полианион NA-5 и карбоцепный полиамин Н-3 вызывают активацию макрофагов, усиливая гликолиз, гексозомонофосфатный шунт, цикл мо­чевины, активность лизосомальных гидролаз. Препараты повышают также экспрессию на плазматической мембране макрофагов Fc_v-peцепторов. Имеются, однако, особенности, состоя­щие в том, что если Н-3 вызывает усиление генерации макрофагами активных кислородных радикалов, полианион NA-5 оказывается в этом отношении неактивным. Поликатион D_11-100э оказывает менее выраженное влияние на макро­фаги, однако существенно повышает на них экс- прессию Рс₇-рецепторов, интенсифицирует цикл мочевины.

Формирование трансплантационного иммуни­тета изучали у животных, которые получали однократно внутрибрюшинно по 1 мг/мышь пре­паратов в день трансплантации кожи.

Результаты свидетельствовали, что все 3 пре­парата вызывали усиление трансплантационного иммунитета, выражающееся в достоверном уско­рении отторжения трансплантата у мышей, кото­рым их вводили. Причем, как и на других моде­лях, в частности при анализе состояния макро­фагов в условиях воздействия препаратов, ак­тивность полииона D_11-100э уступала активности NA-5 и Н-3. Можно сделать вывод, что полиион NA-5 и карбоцепный полиамин Н3 обладают способностью усиливать клеточный Т-опосредованный иммунитет, менее активным был D_11-100э.

АКТИВАЦИЯ МАКРОФАГОВ ПОД ВЛИЯНИ­ЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНТИОКСИДАНТА

Сейчас общепринятой считается закономерность: актива­ция макрофагов (МФ) сопряжена с метаболи­ческим (окислительным) взрывом, с активацией глюкозомонофосфатного шунта (ГМФШ), с про­дукцией и секрецией высокоактивных нестабиль­ных продуктов восстановления кислорода — супероксиданионов О₂~, перекиси водорода (Н₂О₂), радикалов ОН~ и синглетного кислорода (О₂) .

Образующийся при этом избыток токсичных супероксидных радикалов, а также липопереки-си, накапливающиеся в фагосомах МФ в процес­се фагоцитоза, могут обусловливать окислитель­ное повреждение клеточных мембран и связанное с этим подавление функций МФ. У МФ описана собственная система антиоксидантной защиты, включающая супероксиддисмутазу, удаляющую избыток супероксидных радикалов, а также глу-татионпероксидазу и НАДФ-зависимую глутатионредуктазу, нейтрализующие липоперекиси.

Однако при недостаточности эндогенных антиоксидантов могут возникать различные наруше­ния функций МФ. Было показано, что алкилзамещенные производные 3-оксипиридина (8 ОП), оказывающие умеренное антиокисли­тельное действие, являются эффективными инги­биторами свободнорадикальных реакций и могут быть использованы для защиты от деструктив­ного влияния свободных радикалов.

Целью работы было изучение влия­ния синтетических антиоксидантов на функции МФ. Из ряда синтетических производных ОП были выбраны 2-третбутил-З-оксипиридин (ТБОП), у которого была описана способность стаби­лизировать мембраны эритроцитов. Исследование проводились в сравнении со стандартным активатором МФ — бактериальным липополисахарида (ЛПС из Е. coli О55).

Данные, полученные при изучении непосредственного вли­яния ТБОП в сопоставлении с ЛПС на перитонеальные МФ таковы: для ак­тивации ГФДГ достаточно получасовой инкуба­ции клеток с ТБОП. Судя по показа­телям прироста активности фермента, эффект ТБОП аналогичен действию стандартного акти­ватора — бактериального ЛПС. Доля распла­станных МФ возрастает по сравнению с контро­лем уже через 2 ч инкубации с испытуемыми пре­паратами. На ранних сроках (2 ч) эффект ТБОП более выражен по сравнению с эффектом стан­дартного активатора — ЛПС. На бо­лее поздних сроках культивирования (24 ч), ак­тивирующий эффект ЛПС продолжает нарастать, в то же время доля распластанных МФ под вли­янием ТБОП имеет тенденцию к понижению по сравнению с ранними сроками, но остается до­стоверно повышенной в сопоставлении с посте­пенно возрастающим контрольным уровнем.

После внутрибрюшинного введения ТБОП уже через 1 ч он вызывает отчетливое повышение ко­личества клеток в брюшной полости за счет МФ с преимущественным накоплением крупных МФ, причем и этот эффект аналогичен действию ЛПС.

МФ, извлеченные из брюшной полости мышей через 1 ч после внутрибрюшинного введения ТБОП, отличались усилен­ным распластыванием по сравнению с МФ конт­рольных животных. Фагоцитарная активность этих же МФ была повышенной, судя по интенсивности захвата ими клеток Candida albicans. В этих условиях эксперимента ТБОП по срав­нению со стандартным активатором — бактери­альным ЛПС — в большей степени активирует распластывание, а фагоцитарную активность по­вышает в меньшей степени. В более поздние сро­ки после введения исследуемого препарата (1.5— 24 ч) дальнейшего нарастания количества МФ в брюшной полости и их функциональной активно­сти не наблюдали. В отличие от этого после вве­дения ЛПС количество МФ в брюшной полости и их функциональная активность достигали мак­симального уровня лишь через 24 ч.

В связи с выявленными временными различия­ми стимулирующих эффектов при изучении влия­ния препаратов на интенсивность очищения брюшной полости мышей от введенных бактерий S. typhimurium (клиренс) ЛПС вводили за 24 ч, а ТБОП — за 1 ч до заражения. Для оценки клиренса вычисляли средние разности логариф­мов концентрации бактерий через 1 ч после за­ражения у мышей контрольных и опытных групп. Было обнаружено значительное отставание ин­тенсивности клиренса у мышей, получивших за 4 сут до заражения по 1 мл среды с тиогликолятом, по сравнению с контролем.

На рисунке видно, что ни ТБОП, ни стандарт­ный активатор МФ бактериальный ЛПС не вли­яют на интенсивность очищения брюшной поло­сти от введенных бактерий. Однако на фоне де­фекта бактерицидности МФ, индуцированного предварительным введением среды с тиогликолятом, оба препарата в равной степени достоверно повышают исходно сниженную интенсивность очищения брюшной полости мышей. Под влияни­ем ТБОП, как и под влиянием бактериального ЛПС, наблюдали нормализацию уровня очище­ния брюшной полости, т. е. коррекцию модели­рованного в эксперименте дефекта бактерицид­ности МФ.

Таким образом, у изученного синтетического антиоксиданта ТБОП выявлена способность ак­тивировать мышиные перитонеальные МФ при непосредственном воздействии in vitro. После внутрибрюшинного введения того же препарата наблюдали повышение количества МФ в брюш­ной полости и их функциональной активности. У мышей с предварительно индуцированным де­фектом функции клиренса брюшной полости пре­парат способствовал восстановлению нормаль­ного уровня антибактериальной защиты. По всем изученным тестам активирующего действия на МФ синтетический антиоксидант не уступал стан­дартному активатору МФ — бактериальному ЛПС. При введении мышам ТБОП наблюдали более ранние проявления активации МФ по срав­нению с эффектами ЛПС.

Характеристики

Список файлов реферата