kursovik (677434), страница 8

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 8)

Установлено, что способность поддер­живать рост опухолевых клеток прогрессивно снижается у резидентных макрофагов и нарастает у БЦЖ-активированных. Если в первые 3 дня при­рост числа клеток на БЦЖ-активированных мак­рофагах достоверно ниже, чем на резидентных (что может быть объяснено цитотоксической ак­тивностью), то затем наблюдается противополож­ная ситуация.

Таким образом, если индуцированная БЦЖ-активация противоопухолевой активности макро­фагов носит преходящий характер, то активация продукции ростовых факторов более устойчива во времени. Более того, при тестировании цито­токсической и ростстимулирующей активности макрофагов, выделяемых из перитонеальной поло­сти мышей в различные сроки после введения БЦЖ, было выявлено, что цитотоксиче­ская активность (цитолитическая и цитостатиче­ская) максимальна на 10-й день. На 15-й и 20-й дни проявляется только цитолитическая, а цито­статическая активность исчезает. Ростстимулирующая активность максимальна на 15-й и 20-й дни. Следовательно, in vitro активация макрофагов БЦЖ приводит к транзиторной экс­прессии противоопухолевой активности и длительной устойчивой ростстимулирующей активности.

С учетом этих данных становится понятным характер взаимодействия БЦЖ-активированных макрофагов и опухолевых клеток в процессе дли­тельного ко-культивирования in vitro: в первые дни за счет цитотоксичности значительно снижается количество жизнеспособных клеток, одновременно цитостатические факторы тормозят их пролифера­цию, но затем благодаря выделяемым росто­вым факторам интенсивность пролиферации вы­живших опухолевых клеток значительно превы­шает таковую у резидентных макрофагов, в результате чего их общее количество достигает и даже превышает исходный уровень.

В ряде случаев при культивировании малых доз опухолевых клеток — до 10 на лунку (т. е. в соотношении эффектор/мишень 5000:1) — цито­токсической активности может быть достаточно для элиминации всей опухолевой популяции, од­нако в тех случаях, когда ростовая фракция пре­высит определенный порог цитотоксической актив­ности, наблюдается интенсивный рост оставшихся опухолевых клеток. Именно это объясняет отсут­ствие достоверности результатов культивирова­ния малых доз клеток, так как отклонения от сред­ней величины отличались большей амплитудой.

Таким образом, способность макрофагов, акти­вированных БЦЖ, контролировать рост опухоле­вых клеток in vitro ограничена и проявляется только в соотношениях эффектор/мишень, весь­ма далеких от реально возможного in vivo,— 500:1 — 5000:1. При этом противоопухолевая ак­тивность транзиторна, а опухольстимулирующая носит более длительный и устойчивый характер. Поэтому была предпринята попытка потенцировать противоопухолевую активность БЦЖ-активи­рованных макрофагов путем воздействия на них циклофосфамидом. По данным литературы, этот противоопухолевый препарат является вполне «совместимым» с БЦЖ-агентом (т. е. стимулирует БЦЖ-индуцированную цитотоксичность) и, сле­довательно, может быть компонентом комбиниро­ванной химиоиммунотерапии на основе примене­ния БЦЖ .

Циклофосфамид вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг, за 9 дней до того получивших также внутрибрюшинно 1 мг БЦЖ. На сле­дующий день перитонеальные клетки выделяли и оценивали их цитотоксическую активность, способ­ность поддерживать рост опухолевых клеток в суб­оптимальных концентрациях и влиять на рост автономно растущей опухолевой популяции в усло­виях ко-культивирования. Оказалось, что циклофосфамид самостоятельно индуцировал существенную цитолитическую и цитостатиче-скую активности, кроме того, достоверно усиливал БЦЖ-индуцированную цитотоксичность.. При этом в присутствии макрофагов, активированных комби­нацией БЦЖ с циклофосфамидом, уровень пролиферации опухолевых клеток в зависимых от ростовых факторов концентрациях (10² клеток на лунку) был 2,9'10⁴±3,25-10³ и значительно пре­вышал таковой при культивировании опухолевых клеток на БЦЖ-активированных макрофагах — 3,7-10³±1,4-10², практически не отличаясь от их роста в присутствии нестимулированных макрофа­гов — 3,2-10⁴±4,82-10³.

Таким образом, несмотря на весьма высокий уровень цитотоксичности макрофагов, индуциро­ванный их обработкой вслед за БЦЖ еще и цик­лофосфамидом, такие макрофаги теряли способ­ность даже к ограниченному контролю ко-куль-тивируемой с ними популяции опухолевых клеток.

С учетом весьма значительной в этой серии экс­периментов потери клеток под влиянием факторов цитотоксичности (в отдельных опытах цитолитическая активность достигала 70 %) и прироста клеток, сравнимого с таковым после ко-культиви­рования на резидентных макрофагах, можно счи­тать, что совместное применение БЦЖ и цикло­фосфамида оказывает аддитивное действие на продукцию ростовых факторов макрофагами.

Таким образом, имеющиеся в литературе дан­ные о совместимости БЦЖ и циклофосфамида, будучи совершенно справедливыми в отно­шении противоопухолевой активности активиро­ванных макрофагов, не отражают возможного ко­нечного результата такого совмещения, явно неже­лательного с клинической точки зрения. Следует отметить, что характер ответа макрофагов на ак­тивацию МБО in vivo имеет сходство с таковым in vitro. Как показано еще в первых работах по применению БЦЖ, иммунотерапия этим препара­том эффективна только в течение короткого срока, а затем происходит стимуляция опухолевого про­цесса, причем противоопухолевую активность макрофагов, достаточно быстро угасающую как in vitro, так и in vivo, как правило, не удается вос­становить повторными введениями препарата, ее вызвавшего, и в случае успеха такая реактивация кратковременна.

Данные литературы достаточно однозначно ука­зывают на отсутствие корреляции между цитотоксической активностью БЦЖ-активированных мак­рофагов in vitro и их влиянием на опухолевые клетки in.vivo. Если исходить из представлен­ных нами данных, это становится вполне объяс­нимым: уничтожение in vitro даже большинства опухолевых клеток при последующем стимулиро­вании роста оставшихся приводит к явному ни­велированию эффекта цитолитического действия, особенно если учесть его относительную кратко­временность по сравнению с ростстимулирующим действием. Кроме того, выявляемая in vitro цито-статистическая активность зависит от таких фак­торов, как аргиназа, истощение культуральной среды ввиду повышенного метаболизма активи­рованных макрофагов, продукция токсических радикалов, атомарного кислорода и др. В ус­ловиях in vivo эти эффекты могут не проявляться в связи с притоком аргинина, других питательных веществ к клеткам, наличием антагонистов ра­дикалов и т. д.

Как известно, при опухолевом процессе макро­фаги способствуют развитию опухоли на «орган­ном» уровне путем улучшения микроокружения (имеется в виду стимуляция ангиогенеза, форми­рование стромы опухоли, элиминация продуктов распада опухолевых клеток). Продуцируемые макрофагами иммуносупрессивные факторы, в частности простагландин Е2, способны инактивировать другие иммунологические механизмы рези-стентности к опухолевому росту. Такие фак­торы, как интерлейкин-1 (ИЛ-1), фактор некроза опухоли (ФНО), выделяемые активированными макрофагами, способны подавлять пролиферацию большей части известных линий опухолевых кле­ток, однако они являются и стимуляторами роста некоторых из них .

Учитывая высокую степень гетерогенности опу­холевой популяции и усиление роста таковой под влиянием продуктов активированных макрофа­гов, нельзя исключить появления устойчивых и даже зависимых от ФНО и ИЛ-2 клонов. И если в относительно непродолжительных до времени сроках взаимодействия макрофагов и опухолевых клеток в условиях экспериментальных моделей та­кие эффекты не проявятся, то в реальных ус­ловиях вероятностью такого отбора пренебрегать нельзя. Это особенно актуально, если учитывать, что макрофаги практически неизбежно вовлекают­ся в реализацию любого иммунотерапевтического воздействия, поэтому продемонстрирован­ные здесь негативные последствия их активации могут сказаться и на эффективности всей программы иммунотерапии, направленной изначально на другие эффекторы иммунной системы.

Таким образом, продукция макрофагами факто­ров, стимулирующих рост опухолевых клеток, яв­ляется весьма существенным компонентом ответа этих клеток на МБО. Соответственно при оценке и отборе потенциальных МБО необходимо оцени­вать не только их способность к индукции про­тивоопухолевых реакций, но и возможность экс­прессии побочной ростстимулирующей активности. Только углубленное изучение этого вопроса., направленного на выявление факторов, стимулирующих рост опухолевых клеток, путей их биосинтеза в макрофагах и их регуляцию, может лечь в основу разработки методов селек­тивного подавления нежелательных в онкологиче­ской ситуации ростстимулирующих свойств акти­вированных МБО макрофагов при одновременной сохранности и активации их противоопухолевой активности.

ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕ МАКРОФАГИ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО

ПОТЕНЦИАЛА СЫВОРОТКИ КРОВИ

Накопление липидов в гладкомышечных клет­ках (ГМК) и макрофагах интимы аорты является характерной чертой атеросклероза человека и экспериментальных животных. Было показано, что сыворотки крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) с ангиографи-чески подтвержденным коронарным атеросклеро­зом в отличие от сывороток крови здоровых лиц обладают способностью вызывать накопление липидов в культивируемых клетках интимы аорты человека. Это свойство было названо атерогенностью, поскольку накопление липидов сопро­вождалось другими атеросклеротическими прояв­лениями на клеточном уровне — усилением пролиферативной активности и синтеза внеклеточ­ного матрикса. Однако связь между атерогенностью и атеросклерозом окончательно не вы­яснена.

Исследования по этой проблеме основаны на первичном культивировании субэндотелиальных клеток интимы аорты человека. Сложность рабо­ты обусловлена необходимостью постоянного обеспечения стерильным аутопсийным мате­риалом, а также высокой стоимостью выделения и культивирования клеток.

Ранее было показано, что способностью аккумулировать внутриклеточно холестерин при культивировании с атерогенной сывороткой обла­дают ГМК аорты человека и мононуклеарные клетки периферической крови. Эти данные позволяют считать, что для определения атеро-генности сыворотки крови могут быть использо­ваны не только субэндотелиальные клетки ин­тимы аорты.

Целью работы было определение возможности использования легкодоступных перитонеальных макрофагов для определения атерогенности сыво­ротки крови.

Кровь для исследований бы взята у больных ИБС, подтвержденной при коронарной ангиографии, и здоровых доноров. ГМК были выделены из аорты мужчин, взятой в асептических условиях спустя 24 ч после внезапной смерти, ступившей от инфаркта миокарда. Человеческие перитонеальные макрофаги были выделены из асцитической жидкости больных недостаточностью кровообращения. Мышиные перитонеальные МФ получены от нестимулированных мышей.

Влияние сыворотки крови здоровых доноров и больных ИБС на уровень холестерина в клетках

ГМК:

интимы аорты

59±5 110±7 370±43

67±4 118±13 179±10

32±3 95±8 264±31

44±4 108±3 284±28

медии аорты

Мышиные макрофаги

Человеческие макрофаги

В таблице приведено содержание общего хо­лестерина в ГМК интимы и медии аорты челове­ка, в перитонеальных мышиных и человеческих макрофагах, инкубированных 24 ч в присутствии 20 % сывороток крови здоровых доноров и боль­ных ИБС. Видно, что инкубация клеток в 20 % сыворотке крови здоровых доноров не приводит к статистически значимому повышению уровня холестерина в клетках, а инкубация в 20 % сыво­ротке крови больных ИБС вызывает достоверное повышение содержания внутриклеточного хо­лестерина как в ГМК, так и в перитонеальных макрофагах. Таким образом, так же, как ГМК интимы и медии аорты, перитонеальные макрофаги мышей и человека могут быть использованы для оценки атерогенного потенциала сыворотки крови. Кроме того, накопление холестерина в макрофагах происходит в 1,5—2,5 раза быстрее, чем в ГМК. Оба эти факта, а также более легкий способ получения культуры макрофагов позволяют счи­тать, что эти клетки могут быть использованы для оценки атерогенного потенциала сыворотки крови значительно чаще, чем ГМК.

При культивировании мышиных, человеческих макрофагов и ГМК с 10 атерогенными и 10 неатерогенными сыворотками крови установлена пря­мая корреляционная связь между аккумуляцией холестерина в макрофагах и в ГМК интимы аорты. Кроме того, аккумуляция холестерина в человеческих и мышиных макрофагах находится в прямой зависимости от концентрации сыворотки (рис 1) и времени культивирования (рис 1А). При культивировании макрофагов с сывороткой здоровых лиц такого эффекта не выявлено.

Во время инкубации человеческих и мышиных макрофагов с сыворотками крови больных ИБС выявлено повышение содержания в клетке сво­бодного холестерина и триглицеридов в 1,5— 2 раза, эфиров холестерина в 2,5—3 раза. При этом. уровень фосфолипидов не изменялся.

В группе здоровых доноров только у 22 (28 %) из 80 человек сыворотки крови вызывали аккуму­ляцию холестерина в культуре клеток. В группе больных ИБС у 83 % человек сыво­ротки крови вызывали достоверное повышение уровня общего холестерина в макрофагах, т. е. обладали атерогенными свойствами.

Не выявлено корреляции между атерогенностью крови больных ИБС и содержанием в сыворотке общего холестерина, триглицеридов, апо-А1, апо-В и ХС ЛПВП.

Полученные данные свидетельствуют о наличии прямой корреляции между аккумуляцией липидов в ГМК и макрофагах, а также о том, что способ­ность выявлять атерогенность сыворотки крови. При использовании перитонеальных макрофагов не отличается от данных, полученных ранее при использовании ГМК интимы аорты. Во время культивирования перитонеальные макрофаги ак­кумулируют свободный и эстерифицированный хо­лестерин, триглицериды, т. е. те же липиды, кото­рые при инкубации включают в себя ГМК интимы аорты. Использование ГМК затруднено из-за сложностей получения асептического материала в достаточном для работы объеме. Человеческие и особенно мышиные макрофаги лишены этих недостатков. Эти факты доказывают, что культура перитонеальных макрофагов вместе с культурой ГМК интимы аорты может быть использована как тест-система для оценки атерогенного потенциала сыворотки крови.

Макрофаги, возможно, являются одним из глав­ных клеточных акцепторов липидов в сосудистой стенке. Давно уже было показано наличие макрофагов, насыщенных липидами, в атеросклеротических бляшках. Экспериментальные работы, в кото­рых использовалась культура клеток, выявили способность макрофагов интенсивно накапливать эфиры холестерина при инкубации с химически модифицированными липопротеидами.

Характеристики

Список файлов реферата