1625913344-8903f4a71ad640872a209e228a3a0bd4 (531148), страница 84
Текст из файла (страница 84)
coli) и паромомицина (для S. cerevisiae).Таким образом, модель трансляционной (или информационной) супрессии очень удобна для генетического подхода к изучению действиягена. В этих исследованиях родилась интригующая проблема оптимального уровня точности трансляции, определяемая взаимодействиями иРНК, тРНК, рибосом и других компонентов аппарата трансляции.Глава 16.
Теория гена46116.10. Молекулярная биология генаИсследования тонкой структуры генов аналогичные тем, которыеосуществил С. Бензер для фага Т4, были проведены у вирусов, бактерий, грибов, водорослей, дрозофилы и высших растений. Несмотря на различную детализацию внутригенных карт, выявлена общаязакономерность: рекомбинационная делимость гена у всех объектов,огромное число возможных гетероаллельных мутаций, т. е. мутаций, по-разному локализованных в одном и том же гене и дающих,таким образом, начало гетероаллелям.Современная теория гена опирается на ряд крупных достижений: установление сложной структуры гена, соотнесение генетических и физических единиц измерения, расшифровку генетическогокода, выяснение способа его реализации через этапы транскрипциии трансляции и, наконец, на генную инженерию. На основе этих достижений сформировалась область исследований, которую Дж.
Уотсон назвал «молекулярной биологией гена».Выделение и клонирование генов позволяют строить физическиекарты генов при использовании различных рестриктаз. Рестрикционную карту (физическую) можно соотнести с генетической (рекомбинационной) картой гена. Как пример на рисунке 16.20 представлена физическая и генетическая карта гена LYS2 S. cerevisiae.Манипулирование рекомбинантными ДНК, полученными in vitro,позволило распространить методы быстрого картирования мутаций,основанные на использовании перекрывающихся делеций, на многие объекты. Стало возможным определять молекулярную природуи локализовать мутации прямыми методами секвенирования.Перекрывающиеся гены вирусовПоследовательное применение генетического анализа и расшифровка первичной структуры генов вскрыли неожиданныйфакт перекрывания генов у некоторых вирусов.
Так, у ряда РНКсодержащих бактериофагов Е. coli (R17, f2, MS2, QP) были известны всего три гена: репликазы, белка оболочки и созреваниявирусной частицы. Мутации каждого гена, например у фага MS2,некомплементарны между собой, но комплементарны мутациямостальных двух генов. После расшифровки полной нуклеотиднойпоследовательности РНК этих фагов на ней были локализованывсе три гена. Обнаружена, однако, и четвертая группа мутаций,блокирующих лизис зараженной клетки. Эти мутации образовалисамостоятельную группу комплементации, т.
е. на основе функ-462 ftЧасть 4. Структура и функция генаD4D5D7Рис. 16.20. Физическая и генетическая карта локуса LYS 2 дрожжей S. cerevisiae(Д. А. Горденин и др., 1986)Серая полоса, продолженная линией, — ген Z.VS 2 и прилегающая к нему некодирующаяобласть. EcoRI, Bglll, Xhol, BamHl, Hindlll — сайты рестрикции, между которыми указанырасстояния в тысячах пар нуклеотидов. Цифры снизу — точковые мутации, картированные методом перекрывающихся делеций. Треугольник слева — мутация 32 — результатинсерции транспозона Ту1. Темные полосы ниже карты гена — делеции, полученные invitro в гене LYS 2, клонированном в составе векторной плазмиды.Делеции D7 и D8 получены в результате вырезания фрагмента ДНК соответствующимирестриктазами и последующего лигирования концов. Остальные делеции (D1-D6) получены в результате разрезания гена LYS 2 по уникальному сайту Xhol, перевариванияобразовавшихся концов нуклеазой Ва131 в течение различного времени и последующеголигирования.
В этих случаях точное положение концов делеций неизвестно. Стрелки —направление транскрипции и трансляции. Показаны положения кодона инициатора ATGи терминатора TAA трансляцииционального критерия аллелизма их отнесли к самостоятельномугену, для которого уже не оставалось места на РНК бактериофага.Тем не менее путем исследования белкового синтеза in vitro с использованием РНК фага в качестве иРНК было выявлено реальноеГлава 16. Теория генаft 463существование белка L размером в 75 аминокислотных остатков,кодируемого этим новым геном.
Локализовать его удалось благодаря тому, что один из мутантов по гену лизиса нес нонсенс UGA,идентифицированный по взаимодействию с соответствующимисупрессорными тРНК. У этого мутанта была расшифрована первичная структура РНК. Оказалось,что UGA возник в результатезамены С на U в кодоне CGA (Арг).
Таким образом была установлена фаза считывания триплетов в гене лизиса: слева нашли кодонинициатор (AUG), а справа — терминатор (UAA). Между AUG иUAA как раз располагаются 75 триплетов.Оказалось, что идентифицированный таким образом ген локализован частью в гене белка оболочки (47 оснований), частью в межгенном интервале (36 оснований) и частью в гене РНК-репликазы(142 основания).Аналогичная ситуация обнаружена для некоторых генов одноцепочечных ДНК-содержащих фагов Е.
coli фХ174, G4 и др., о чем мыуже упоминали в главе 10 (см. рис. 10.11), а также для вируса млекопитающих SV40.Перекрывание генов — нередкое явление у вирусов и транспозонов, но оно вовсе не означает, что код может быть перекрывающимся. В каждом из перекрывающихся генов триплеты все так же считываются с фиксированной точки (хотя и в иной рамке считывания),и каждый нуклеотид принадлежит одному кодону.Мозаичные гены эукариотБлагодаря успехам молекулярной генетики, казалось бы, устанавливались «правила игры» в молекулярной биологии гена. Колинеарность гена и кодируемого им полипептида определяет соответствиепервичной структуры белка тому, что записано в виде чередованиянуклеотидов в гене. Тем не менее в конце 70-х годов XX в.
выяснилось, что у эукариот нередко встречаются гены, содержащие «лишнюю» ДНК, — целые участки, не представленные в молекуле иРНКи, таким образом, не считываемые на рибосоме.Благодаря клонированию выделенного из хромосомы гена, егоможно получить в препаративных количествах. При помощи обратнойтранскриптазы можно синтезировать кДНК, комплементарную иРНК,направляющей синтез данного белка на рибосомах. Далее такую кДНК(или непосредственно иРНК) можно in vitro гибридизовать (предварительно расплавив водородные связи нагреванием) с ДНК гена.
Когдатакая работа была проделана, например, с геном, кодирующим куриный овальбумин, оказалось, что гетеродуплекс образует лишь часть464 ftЧасть 4. Структура и функция генаыM bo II Нае IIITag I Sst Hinf M bo IIИчЫEcoRIс \оEcoRIEcoRI*VEcoRIUAAEcoRIIРис. 16.21.
Физическая карта гена куриного овальбумина (F. Ayala, J. Kiger, 1980)А — чередование интронов (темные участки) и экзонов (светлые участки).Показаны сайты рестрикции. Внизу — расстояния в тысячах пар нуклеотидов междусайтами EcoRI. Б — результат гибридизации иРНК и ДНК гена: 1 — электроннаямикрофотография; 2 — графическая реконструкцияхромосомной ДНК. Вместе с тем гибридная молекула содержала несколько одноцепочечных петель, образуемых участками хромосомнойДНК, не представленными в молекуле иРНК (см.
рис. 16.21). Эти последовательности получили название вставок, или интронов (от англ.Intervening sequences). Последовательности гена, представленные в молекуле иРНК, назвали экзонами (от англ. expression).Такая интрон-экзонная, или мозаичная, структура гена характерна для млекопитающих, реже встречается у высших растений идрожжей. Интроны обнаружены в генах митохондрий. У эубактерийинтроны вообще отсутствуют или чрезвычайно редки.Благодаря использованию в качестве зонда радиоактивной кДНКкуриного овальбумина и некоторых других мозаичных генов удалосьпоказать, что в ядрах существуют молекулы РНК — так называемыепро-иРНК, содержащие как экзоны, так и интроны. Следовательно,первичный транскрипт мозаичного гена содержит всю нуклеотидную последовательность, соответствующую гену. В дальнейшемГлава 16.
Теория генаft 465Ген кукол очногокути кул ярного белка47 тпнib c0,9 тпн3 поли-АИнтрон-экзонная карта гена Gart и расположенного в его интроне гена куколочного кутикулярного белка дрозофилы (H enikoff et al„ 1986. - Из: Ж имулев, 1994. С. 147)Рис. 1 6 .2 2 .удаление интронов происходит при созревании про-иРНК, в ходекоторого экзоны ковалентно соединяются в молекулу иРНК.
Этотпроцесс получил название сплайсинг (от англ. морского терминаto splice — сращивать канаты без узлов). В некоторых случаях в интронах обнаруживают открытые рамки считывания, соответствующие самостоятельным генам (см. рис. 16.22).Известен пример генетического кодирования единой полипептидной цепи глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы человека двумя генами,находящимися в разных хромосомах (шестой и Х-хромосоме). Такая ситуация возможна благодаря существованию механизма транссплайсинга, когда два самостоятельных транскрипта объединяютсяподобно тому, как объединяются экзоны после вырезания интроновиз предшественника иРНК.Созревание иРНК у эукариот включает не только сплайсинг, но инекоторые дополнительные ее модификации: присоединение к 5'-концу7-метилгуанозина, или «кэпа», — процесс кэпирования, а также добавление к 3'-концу от нескольких десятков до нескольких сотен остатковадениловой кислоты — полиаденилирование. Эти модификации необходимы для нормального функционирования эукариотических иРНК.Итак, рассмотрены историческое развитие теории гена и ее современное состояние.
Ген рассматривают как участок молекулы ДНК, кодирующий синтез полипептидной цепи или иной функционирующеймолекулы, например тРНК, рРНК. Наряду с генами в ДНК присутствуют и другие генетические элементы: последовательности теломер, центромер, повторяющиеся последовательности нуклеотидов, функциональное значение которых не всегда известно, а также регуляторныепоследовательности, о которых более подробно рассказано в главе 17.Как мы уже отмечали, пути переноса информации, закодированной в ДНК, обобщены Ф. Криком в виде центральной догмы молекулярной биологии, которая одновременно отражает направления466 ftЧасть 4. Структура и функция генаОматричных процессов в клетке(рис.
16.23). Схема, представленная на этом рисунке, означает, чтоДНКгенетический материал — ДНКЧчвоспроизводится при репликач\\чции. ДНК служит матрицей РНК,\которая, в свою очередь, служит\чматрицей для полипептидныхчцепей. Таким образом, инфорБелокРНКмация, закодированная в после4довательности нуклеотидов, воч/площается в последовательностиаминокислот. Возможны и осоРис. 16.23. Центральная догмабые случаи: репликация РНК,молекулярной биологии, отражающаяобратная транскрипция, котораяперенос генетической информации вматричных процессах клетки.представляет собой репликациюСплошные стрелки — распространенныеДНК по матрице РНК; в редкихпроцессы, пунктирные — наблюдаемые в случаях возможна трансляцияособых случаяхнепосредственно ДНК, что былопоказано при действии некоторых антибиотиков, в присутствии которых рибосомы могут связываться с однонитевыми кольцевыми ДНК и их транслировать.«Запрещено» воспроизведение нуклеиновых кислот по матрицеполипептидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
