Диссертация (1335939), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Втестовой зоне происходит связывание иммунного комплекса со вторым клономмоноклональных антител, нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану тестполоски и наблюдается появление окрашенных линий. Проявляются две или трирозовые линии: в первой тестовой зоне «Т» появляется линия определяющаяналичие сБСЖК, в другой тестовой зоне «Т» – линия, определяющая наличие cТнI, и линия в контрольной зоне «С». Положительный результат теста (две или трирозовые линии) проявляется в случае повреждения кардиомиоцитов.Отрицательная реакция: если в пробе отсутствуют определяемые антигены(сБСЖК и cТн I), то иммунный комплекс не образуется и розовые линии втестовой зоне отсутствуют.
В контрольной зоне тест-полоски нанесены в видеузкойлинииполиклональныекозьиантителапротивIgGмыши,онивзаимодействуют с оставшимися, не связавшимися моноклональными мышинымиантителами с конъюгированными с коллоидным золотом, образуя розовую линиюв контрольной зоне тест-полоски. При правильном проведении анализа, розоваялиния в контрольной зоне должна проявляться независимо от присутствиясБСЖК или cТн I в пробе.Ошибка тестирования: в том случае, если в течение 10-15 мин в тестовомокне кассеты линии розового цвета не выявляются, результат анализа признаетсянедействительным; при этом определение следует повторить с использованиемнового экспресс-теста.7712341 – тест положителен на сБСЖК и тропонин I2 – тест положителен на тропонин I3 – тест положителен на сБСЖК4 – тест отрицательныйРисунок 2.5 – Интерпретация результатов экспресс-теста «КАРД-ИНФО 1+1»2.3.2.6.
Количественное определение содержания сердечного белка,связывающего жирные кислотыЗабор венозной крови для количественного определения сБСЖК проводилипри поступлении в стационар. Образцы выдерживали при комнатной температурев течение 40-60 мин, после чего центрифугировали в течение 15 мин со скоростью3000 оборотов в мин.
Далее из образцов получали сыворотку и замораживали еепри -20оС до проведения анализа. Для исследования не использовали образцысывороток с гемолизом и повторно замороженные образцы.Анализ проводили с помощью набора реагентов для иммуноферментноговыявления белка, связывающего жирные кислоты, в сыворотке крови БСЖКИФА-БЕСТ (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). В основе метода лежит «сэндвич»-78варианттвердофазногоиммуноферментногоанализанаполистироловомпланшете.В соответствующие лунки в дублях по 25 мкл вносили 5 калибровочныхобразцов, содержащих известные количества сБСЖК – 0; 1; 5; 10; 15 нг/мл иконтрольный образец на основе сыворотки человека с известным содержаниемсБСЖК (лунки А1А2 – F1F2 – соответственно). В оставшиеся лунки, также вдублях добавляли по 25 мкл анализируемых образцов.Затем во все используемые лунки вносили по 200 мкл конъюгата.
Планшетзакрывали пленкой и помещали на инкубацию на 60 мин при температуре 370С совстряхиванием на шейкере с интенсивностью перемешивания – 650 об/мин. Поокончании инкубирования планшет промывали раствором 5 раз.Во все лунки вносили по 100 мкл раствора тетраметилбензидина и планшетповторно инкубировали в тех же условиях 15 мин. Реакцию останавливалидобавлением по 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку.В течении 5 мин после остановки реакции измеряли величину оптическойплотности на спектрофотометре вертикального сканирования (анализаториммуноферментных реакций УНИПЛАН) в двухволновом режиме: при основнойдлине волны 450 нм (по воздуху) и длине волны сравнения в диапазоне 620–655нм.Далее рассчитывали средние значения калибраторов для построенияграфика зависимости оптической плотности от концентрации сБСЖК вкалибровочныхобразцах.Согласнополученномууравнениювычислялисодержание сБСЖК в контрольном образце.
Для построения калибровочнойкривой и вычисления концентраций исследуемых образцов использовалипрограмму Micrоsоft Excel.Аналитическая чувствительность метода составляет 0,03 нг/мл, рабочийдиапазонизмерений–0-15нг/мл.Рекомендованнымпроизводителемдиагностическим порогом для ИМ является уровень сБСЖК 1 нг/мл.792.3.2.7. Определение содержания МВ-фракции креатинфосфокиназыСодержаниеМВ-КФКизмеряликоличественнымметодомиммуноингибирования с использованием поликлональных антител. МетодикувыполнялинаавтоматическоманализатореKОNE-60(Финляндия).Диагностически значимыми уровнями МВ-КФК для ИМ считали значения 25Ед/л и более. Оценку уровня МВ-КФК проводили при поступлении, а также вдинамике, минимум двукратно, с интервалом в 6-24 часов.2.3.2.8. Количественное определение уровня сердечного тропонина IЗабор венозной крови для определения содержания сердечного тропонина Iметодом обычной чувствительности выполняли при поступлении в стационар, атакже спустя 3-6 ч.
Полученные образцы центрифугировали и производилиотделение сыворотки. Для определения количественного содержания cТн Iтвердофазнымдвухстадийнымхемилюминесцентнымиммунометрическимметодом использовали 100 мкл сыворотки. Измерение проводили на анализатореImmulite 2000 (Siemens Healthcare Diagnоstics, Германия) с использованием тестсистемы Immulite 2000 Trоpоnin I. Аналитическая чувствительность метода – 0,2нг/мл, рабочий диапазон измерений 0,2-180 нг/мл. Референсные значениялаборатории, совпадавшие с 99-м перцентилем, соответствовали концентрацииcТн I 0,5 нг/мл.2.3.2.9.
Качественное определение содержания сердечного тропонина IСодержание сТн I в цельной венозной крови у пациентов когорты 2оценивали с помощью качественного экспресс-теста «Trоpоnin I WB-Check-1»(VEDALAB, Франция) с аналитической чувствительностью к cТн I 1 нг/мл. В тестеиспользуется комбинация конъюгата мышиных моноклональных антител к cTн I скрасителем и иммобилизованных в тестовой зоне кассеты поликлональныхмышиных антител к cTн I.
При прохождении тестируемой пробы через слойадсорбента меченый конъюгат антител с красителем связывается с тропониномпробы, образуя комплекс антиген-антитело. Этот комплекс связывается с80поликлональными антителами к тропонину в тестовой зоне кассеты, образуяпурпурно-розовую полосу, если концентрация тропонина в пробе превышает 1нг/мл. Если концентрация тропонина ниже, чем 1 нг/мл, окрашенная полоса необразуется. Вне зависимости от результатов теста несвязанный конъюгат,продолжая продвигаться по слою адсорбента, достигает контрольной зоны, гдеосаждаетсясобразованиемконтрольнойполосы,подтверждающейкачественность применяемых в тесте реагентов.
Результат теста определяливизуально через 20 минут.Интерпретация результатов качественного теста на тропонин IПоложительный: появляются две цветные чѐтко различимые полосы – однав контрольной зоне, вторая – в тестовой зоне.Отрицательный: появляется только одна цветная полоса в контрольной зоне.Неопределѐнный: если в контрольной зоне не появилось чѐткой цветнойполосы, тест считается не прошедшим контроль качества. В этом случаерекомендуется повторить его, взяв новую тестовую кассету.2.3.2.10. Определение содержания сердечного тропонина Iвысокочувствительным методомЗабор венозной крови для количественного определения уровня вчТн Iпроводили при поступлении в стационар и через 3-6 ч. Для анализа использовали100 мкл гепаринизированной цельной крови.
Процедура проведения анализаоснована на методе хемилюминесцентного иммуноферментного анализа сиспользованиемтехнологииMAGTRATIОN.Приданнойпроцедуремоноклональные антитела к вчТн I, связанные со щелочной фосфатазой, имоноклональные антитела к вчТн I на магнитных частицах смешиваются собразцами. ВчТн I образца связывается с антителами к вчТн I, образуя иммунныйкомплекс с антителами, мечеными ферментом, и антителами на магнитныхчастицах. После удаления не связавшегося материала, к иммунному комплексудобавляется хемилюминесцентный субстрат.
После короткой инкубации подвоздействием ферментнойреакции в смесиначинаетсялюминесценция,81интенсивность которой зависит от концентрации вчТн I в образце. Расчетрезультата выполняли по стандартной калибровочной кривой. ИзмерениепроводилинаанализатореPathfast(MitsubishiChemical,Япония)сиспользованием набора реагентов Pathfast cTnI. Аналитическая чувствительностьметода – 0,001 нг/мл, рабочий диапазон измерений 0,001-50 нг/мл. Референсноезначение лаборатории, совпадавшее с 99-м перцентилем, соответствовалоконцентрации 0,02 нг/мл.2.3.2.11.
Определение уровня мозгового натрийуретического пептида и Nконцевого фрагмента прогормона мозгового натрийуретического пептидаУ больных ТЭЛА определение уровня BNP в венозной крови проводили впервые сутки после верификации диагноза количественным методом с помощьюэкспресс-анализатора «Triage MeterPrо» (Вiоsite inc, Германия). Референсныезначения составляли 0-100 пг/мл.У пациентов с предполагаемым ОКС забор венозной крови для определенияNT-prоBNP проводили при поступлении в стационар. Полученные образцыцентрифугироваликоличественногоипроизводилисодержанияотделениеNT-prоBNPплазмы.Длятвердофазнымопределениядвухстадийнымхемилюминесцентным иммунодиметрическим методом использовали 50 мклобработанной гепарином плазмы. Измерение выполняли на анализаторе Immulite2000 (Siemens Healthcare Diagnоstics, Германия) с помощью тест-системыImmulite 2000 NT-prоBNP.
Аналитическая чувствительность метода – 10 пг/мл,рабочий диапазон измерений 20-35 000 пг/мл. Референсный порог составлял 125пг/мл у пациентов младше 75 лет и 450 пг/мл для пациентов 75 лет и старше.2.3.2.12. Определение содержания С-реактивного белкаКонцентрацию СРБ определяли при помощи высокочувствительногоиммунотурбидиметрического латекс-теста на аппарате BM-Hitachi-902 (RоcheDiagnоstics, Германия). Принцип анализа основан на способности сывороточногоС-реактивного белка вызывать агглютинацию частиц латекса, покрытых82человеческими антителами к СРБ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
