Диссертация (1174218), страница 13
Текст из файла (страница 13)
При высокойплотности материала первоначальное время декальцинации составляло 20-30минут, с последующей оценкой плотности. При необходимости продолжитьдекальцинацию,материалоставлялиповторновдекальцинирующемрастворе на 15 минут, с последующей оценкой плотности. По достижениисоответствующей консистенции, материал направлялся в гистологическуюпроводку.Применялась автоматизированная гистологическая проводка материалас использованием аппарата для гистологической проводки вакуумного типаSakura Tissue-Tek VIP5 Jr (Sakura).73Гистологическая заливка исследуемых тканей осуществлялась наавтоматизированной станции Slee MPS/P.Все полученные срезы окрашивались гематоксилином и эозином(Tissue-Tek Prisma, Sakura) по специальному протоколу и накрывалисьавтоматически (Tissue-Tek Film, Sakura).В случае невозможности верифицировать диагноз применялисьдополнительныеметоды(иммуногистохимическоецитогенетическоеисследование,исследование,молекулярно-генетическое(Sangersequencing) и др.).2.2.6 Критерии качества гистологических препаратов.Толщина срезов не превышала 3-4 мкм.
Срез был равномерно окрашен,все клеточные элементы и костные структуры располагались в однойплоскости. В костном компоненте было легко различимо пластинчатое и/илигрубоволокнистое строение. При большом увеличении микроскопа (х400)были хорошо различимы цитологические характеристики клеток (ядро,распределение хроматина, фигуры митозов, апоптотические тельца и т.д.).2.2.7 Микроскопическое описание.Кмикроскопическомуописаниюгистологическихпрепаратовприступали только после ознакомления с клинической информацией опациенте и изучения рентгеновских снимков (и/или КТ/МРТ исследований).В описании фиксировались все выявленные изменения с указанием,при необходимости, их соотношения.Подробно описывали из каких компонентов состоит образование сподробной характеристикой каждого, распространенность (вовлечение впатологический процесс надкостницы, мягких тканей и др.), митотическаяактивность,наличиеклеточнойатипии,зоннекроза.Указывалисьособенности перифокальных реактивных изменений костной ткани иприлежащих мягких тканей.74Вовремяописаниягистологическихизмененийпроводилосьсопоставление с рентгеновскими снимками (и/или КТ/МРТ-исследованиямипри их наличии) и клиническими данными пациентов (анализировалисьсоответствующие истории болезни, амбулаторные карты и выписки в случаеконсультативного материала).2.2.8 Иммуногистохимическое исследование.В исследовании были использованы два антитела к гистоновымбелкам: H3.3 G34W (кроличье моноклональное антитело RM263, RevMAbBiosciences USA) и H3F3 K36M (кроличье моноклональное антитело RM193,RevMAb Biosciences USA).Рабочие разведения (для всех антител 1:1000) были подобраны наконтрольных блоках ГКО и ХБ с наличием соответствующих мутацийгистоновых белков H3F3A (для ГКО) и H3F3B (для ХБ), выявленных присеквенировании по Сенгеру.
Позитивным результатом считалось наличиеядерной экспрессии соответствующих антител. Отрицательным результатомсчиталосьотсутствиеядернойэкспрессии.Всеэтапыиммуногистохимического исследования были проведены с использованиемполностью автоматизированной системы Ventana Bench-Mark Ultra споследующим докрашиванием гематоксилином (Tissue-Tek Prisma, Sakura)поспециальномуавтоматическипротоколу(Tissue-TekFilm,инакрывалисьSakura).покровнойДалееготовыепленкойпрепаратыоценивались методом световой микроскопии.2.2.9 Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).Для выявления транслокаций, вовлекающих ген USP6, локализованныйв районе 17p13.2, был использован зонд Zyto Light SPEC USP6 Dual ColorBreak Apart Probe (Pl 107, ZitoVizion GmbH, Germany).Флуоресцентная гибридизация in situ проводилась на препаратах,изготовленных путем помещения срезов исследуемой ткани толщиной 4-575мкм на специальные предметные стекла (SuperFrost), которые оставляли нанагревательном столике в течение 8 часов при температуре 60 градусов поЦельсию, затем помещали в ксилол (3 раза по 5 минут при комнатнойтемпературе).
Далее два раза проводилив 96% этаноле по 3 минуты.Гидратациявыдерживаниемсрезовпроизводиласьпрепаратовпоследовательно по 3 минуты в 85% и 70% этаноле и дистиллированной водепри комнатной температуре. Затем препараты переносили в 0,01 М растворцитрата натрия и инкубировали 15 минут при 96 градусах по Цельсию споследующей промывкой в дистиллированной воде два раза по 2 минуты.Срезы обрабатывали раствором пепсина (LK-101B, Kreatech Diagnostics,Leica Biosystems, Germany) 20-50 минут при комнатной температуре,промывали дистилированной водой и оставляли на 5 минут в растворе 2хSSCрН 7,0. Затем срезы дегидратировали в 70%, 85% и 96% этаноле (1 минута вкаждом растворе).
На высушенный препарат наносили 8-10 мкл зонда USP6,растворенного в гибридизационной смеси (Zyto Light SPEC USP6 Dual ColorBreak Apart Probe), и накрывали покровным стеклом 18х18 или 22х22 (взависимости от размера среза). Далее препарат подлежал окантовкерезиновым клеем для предотвращения высыхания с последующей коденатурацией 10 минут при температуре 75 градусов по Цельсию сиспользованием твердотельного термостата. Переносили препарат вовлажную камеру и оставляли для гибридизации при температуре 37 градусовна 12-18 часов в термостате. Затем клей удаляли. Снятие покровного стекла ипостгибридизационную отмывку проводили в соответствии с протоколомпризводителя (ZytoLightFISH, ZitoVizion, Germany).Анализ результатов FISH-исследования проводили на флуоресцентноммикроскопе, оснащенном светофильтрами, необходимыми для просмотрафлуорохромов ZyGreen и ZyOrange, которыми мечен зонд Zyto Light SPECUSP6DualColorBreakApartProbe.Фотосъемкупроизводилисиспользованием черно-белой CCD-камеры.
Цветные изображения получали всреде компьютерной графической программы Adobe Photoshop CC 2014.762.2.10 Секвенирование по Сенгеру.ИспользовалиметодпрямогосеквенированияпоСенгерудляопределения мутаций в 27, 28, 35 и 37 кодонах гена H3F3A и 35 и 37 кодонахгена H3F3B каждого образца. Геномную ДНК выделяли из опухолевой тканификсированной формалином и залитой в парафин с использованием набораPCR Qiagen (Qiagen, Valencia, CA, США) в соответствии с инструкциямипроизводителя.Полимеразнуюиспользованиемследующихцепнуюпарреакциюпраймеров:GTCTCTGTACCATGGCTCG-3’ипроводилиH3F3A_F5'-H3F3A_RAGTTTTCCTGTTATCCATCTTTTTG-3’;5’-H3F3B_FATCTTCGGGGCGTCTTTCTTAGGTG-3’ис5’-H3F3B_R15’-AGGGGAGGAGTGAGCGGAC-3’. Реакционная смесь для амплификациисодержала 5-20 нг ДНК, 1х ПЦР-буфера, по 200 мкмоль/л dATP, dCTP, dGTPи dTTP, 3 ммоль/л MgCl2, ДНК-полимеразу SynTaq (Синтол), и 200 нмоль/лкаждого ПЦР-праймера, MQ до 25 мкл. Условия амплификации былиследующими: 95 °С -5 мин; 40 циклов: 95°С – 30 сек, 63°С – 30 сек, 72°С – 30сек; 72°С – 5 мин.
Продукты ПЦР детектировали методом электрофореза в2% агарозном геле, очищали с использованием набора для очистки CleanupMini (Евроген) и затем секвенировали с использованием Big Dye TerminatorCycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциямипроизводителя.Полученныеданныепоследовательностибылипроанализированы с использованием программного обеспечения SequenceScanner Software 2.2.2.11 Формулировка заключения.Заключение было сформулировано с учетом анамнеза, локализациипатологического очага, данных лучевой диагностики и обязательнойкорреляциейсморфологическойкартиной,иммунофенотипомирезультатами секвенирования по Сенгеру (для тех случаев, при которых оно77проводилось).Конкретнаянозологическаяединицауказываласьвсоответствии с МКБ последнего пересмотра.Приневозможностидостовернойформулировкидиагноза(недостаточный объем материала, тотальный некроз и т.д.), в заключенииуказывалихарактервыявленныхпригистологическомисследованииизменений (реактивные, воспалительные, некротические изменения и т.д.).2.2.12 Архивирование материала.Весь исследованный материал хранился в сыром архиве до моментаоформления заключительного диагноза.
После чего оставляли в архиветолько опухоль или ее часть.Материал в парафиновых блоках хранили неограниченное время.Все гистологические препараты были отсканированы на аппарате LeicaAperio AT2 с целью создания электронного архива оцифрованныхмикропрепаратов в рамках данного исследования.78Глава 3.Результаты собственных исследований.3.1 Гигантоклеточная опухоль (ГКО).При пересмотре архива доступных случаев опухолей костей у детей,мы обнаружили 19 документированных заключений с диагнозом «ГКО».Всем пациентам было проведено хирургическое лечение (пункция, кюретажили тотальная резекция образования). В каждом случае (при условиидоступности информации) были проанализированы данные анамнеза (пол,возраст,локализация,рентгенологическогожалобы,(КТ/МРТ)проведенноеисследованиялечение),(приданныеналичии)игистологический материал.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
