Диссертация (1154691), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Для выделения у животных вызванных потенциаловнерва (ВП) регистрирующий электрод располагали на седалищном нерве выше иниже места повреждения (Рис. 5А). Для регистрации вызванного мышечногоответа (М-ответа) игольчатый электрод находился в икроножной мышце(Рис.
5Б). Нерв раздражали прямоугольными импульсами, длительностью 0,1 мс,частотой 1 Гц. Величина тока увеличивалась до появления устойчивого,с максимальной амплитудой неврального и мышечного ответов. При ЭНМГисследовании изучались основные параметры вызванных потенциалов: латентныйпериод (ЛП) и амплитуда.Рисунок 5 – Методика ЭНМГ–исследований у животных:А – стимулирующий электрод на седалищном нерве; Б – игольчатый электрод викроножной мышце54552.3.3 Методы исследования биохимических показателей сыворотки кровиДля проведения биохимических исследований у животных на 7-е и 21-есутки наблюдения выполняли забор крови в количестве 6 мл.
Взятие крови дляисследования производили методом пункции правых отделов сердца. Для сборакрови использовали пробирки BD Vacutainer с разделительным гелем (BD, США).Для получения сыворотки кровь оставляли для свертывания при комнатнойтемпературе, центрифугировали при 2000 оборотах/мин в течение 10 минут.Полученную сыворотку хранили в морозильной камере LIEBHERRBGPV 6520 (Германия) в при температуре -20ºС не более 3 месяцев.Исследование уровня нейротрофина-3 (NT-3), тяжелого полипептиданейрофиламентов (NEFH), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в сывороткекровипроводилиметодомтвердофазногоиммуноферментногоанализа,с использованием наборов реактивов ELISA Kit for Neurotrophin 3 (NT-3)(USCN Life Science Inc, КНР), ELISA Kit for Neurofilament (NEFH) (USCN LifeScience Inc, КНР), VEGF Rat (RnD Systems, США), на автоматическоммикропланшетном спектрофотометре «EpochBioTek Instruments» (США).2.3.4 Методы исследования гистологических препаратов седалищного нерваи зоны аутотрансплантации полнослойного кожного лоскутаМатериал для морфологического исследования фиксировали в 10%-номрастворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали вспиртах восходящей плотности, заливали в парафин.
Срезы толщиной 5-7 мкмокрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином(ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли монтирующуюсреду Bio-Mount.Исследование препаратов проводили при помощи микроскопа AxioImager Z2(Carl Zeiss, Германия).На серии поперечных срезов окрашенных микропрепаратов сшитогоседалищного нерва животных определяли среднее количество неизмененных,регенерирующих и дистрофированных нервных волокон в проксимальном5556(выше шва) и дистальном (ниже шва) участках нерва в поле зрения приувеличении х1000.ПригистоморфологическомисследованиизоныАТПКЛоценивалиструктуру, состояние микроциркуляторного русла, лейкоцитарную инфильтрациюокружающих аутотрансплантат мягких тканей (дермы и гиподермы), состояниеэпидермиса и дермы аутотрансплантата.
При оценке динамики клеточныхпопуляций дермы аутотрансплантата определяли количество фибробластов,фиброцитов, нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и макрофагов, а такжелимфоцитов в поле зрения при увеличении х400.2.4 Статистическая обработка данныхСтатистическую обработку осуществляли средствами программы Statistica10.0. Проверяли гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро-Уилкса).Большинство полученных данных не соответствовали закону нормальногораспределения,поэтомудляихобработкииспользовалиметодынепараметрической статистики: расчет медианы и верхнего и нижнего квартиля,а для сравнения значений – U-критерий Манна-Уитни, на основании которогорассчитывались Z–критерий и показатель достоверности p.
Критический уровеньзначимости при проверке статистических гипотез в данном исследованиипринимали равным 0,05.5657Глава 3 Влияние аутотрансплантации полнослойного кожного лоскутана динамику микроциркуляторных, электронейромиографическихи морфологических показателей у крыс при нейрорафии седалищного нерва[А.Н. Иванов и др., 2016d]В представленной главе экспериментальные исследования были выполненына двух группах животных.
Первая - группа сравнения, включала в себяживотных,которымвыполнялосьоперативноевмешательствовобъемепересечения седалищного нерва с его последующей нейрорафией. Вторая группавключалавсебяживотных,которымвыполняласьаутотрансплантацияполнослойного кожного лоскута в межлопаточной области одновременнос нейрорафией нерва после его пересечения.3.1 Изменение микроциркуляторных, электронейромиографических иморфологических показателей у крыс при нейрорафии седалищного нерваДля оценки комплекса нарушений, происходящих у животных приоперативномвмешательствемикроциркуляторные,наседалищномнервеэлектронейромиографическиеибылиизученыморфологическиепараметры белых крыс, которым выполнялась нейрорафия.На 21-е сутки после нейрорафии, у животных группы сравнения отмечалисьдвигательные нарушения, крысы щадили оперированную конечность, избегалиопоры на неё. Также отмечались выраженные трофические изменения – отекстопы, выпадение волос в нижней трети голени, у 60 % крыс на стопенаблюдались изъязвления на коже.57583.1.1 Изменения микроциркуляторных показателей при нейрорафииседалищного нерва [А.Н.
Иванов и др., 2014b].В связи с тем, что у животных данной группы в оперированной конечностик 21-м суткам наблюдаются выраженные трофические изменения былиисследованы показатели состояния микроциркуляторного русла методом ЛДФна 7-е, 14-е и 21-е сутки после оперативного вмешательстваНа 7-е сутки после оперативного вмешательства регистрируется значимоеснижение перфузионного показателя относительно контрольных значений,атакжеизменениеактивныхмеханизмоврегуляциимикрокровотока,характеризующееся уменьшением нормированных амплитуд эндотелиальныхи нейрогенных колебаний, при этом нормированные амплитуды миогенныхколебаний от контрольных показателей отличий не имеют (табл. 1).При анализе микроциркуляторных параметров на 14-е сутки послеоперативного вмешательства было установлено, что перфузионный показательстатистически значимо ниже уровня контрольных значений.
Регистрируемыенормированные амплитуды эндотелиальных и нейрогенных колебаний сохраняютнизкий уровень относительно контроля. При этом перфузионный показатель,а также нормированные амплитуды нейрогенных и миогенных колебанийотличий отпоказателей, зарегистрированных на7-есуткинеимеют.Нормированные амплитуды эндотелиальных колебаний статистически значимовыше, чем на 7-е сутки (табл. 1).На 21-е сутки после оперативного вмешательства отмечается достовернонизкий уровень перфузионного показателя относительно контроля и отсутствиестатистической значимости при сравнении с значениями 7-х и 14-х суток.При этом нормированные амплитуды эндотелиальных колебаний имеюттенденцию к нормализации и превышают уровень значений, зарегистрированныхна 7-е сутки.
Нормированные амплитуды нейрогенных колебаний сохраняютзначимо низкий уровень по сравнению с контрольными показателями, однакоотмечается тенденция к повышению их среднего значения. Нормированные5859амплитуды миогенных колебаний отличий от контроля, показателей 7-х и 14-хсуток не имеют (табл. 1).Таблица 1Динамика микроциркуляторных показателей кожи тыльной поверхности стопыв группе сравненияГруппаПоказателиПоказатель перфузии,перф.ед.Группа сравнения (n=16)Контроль(n=15)7 сутки8.5(6.7;9.4)p1=0.00025311.6(10.1;13.3)Нормированные амплитудыколебаний,13.01(10.33;17.93)Эндотелиальных11.3(10.52;12.62)Нейрогенных6.55(5.00;7.88)МиогенныхПримечания: в каждом случае приведены14 сутки7.45(6.65;8.45)р1=0.000006p2=0.86249021 сутки8.15(7.75; 10.00)p1=0.000126p2=0.052023p3=0.0483087.29.4111.71(5.29;9.19)(8.34;11.76)(8.59;13.32)p1=0.001648р1=0.005960p1=0.059656p2=0.026023p2=0.034077p3=0.3234826.97.17.64(4.95;9.32)(5.43;7.96)(6.80;8.58)p1=0.000139р1=0.000005p1=0.000051p2=0.707454p2=0.034077p3=0.1332847.46.837.19(5.97;9.22)(5.27;8.1)(6.47;10.32)p1=0.826200р1=0.828468p1=0.064314p2=0.707454p2=0.885234p3=0.189545медиана, верхний и нижний квартили; p1, p2, p3 – посравнению с контролем, 7-ми, 14-ми и 21-ми сутками соответственно.Таким образом, при пересечении и последующем сшивании седалищногонерва у животных развиваются нарушения микроциркуляции.
На всех этапахрегистрации отмечается снижение перфузионного показателя, характеризующегонедостаточноекровоснабжениеоперированнойконечности.Максимальноеснижение перфузионного показателя наблюдается на 14-есуткипослеоперативного вмешательства. Изменение перфузии сопровождаются угнетениемактивных механизмов контроля состояния микроциркуляторного русла, вчастностипроисходитнарушениенейрогенного59механизмарегуляции,60выражающееся в статистически значимом снижении нормированных амплитуднейрогенных колебаний на всех этапах регистрации ЛДФ-грамм. В первые двенедели после нейрорафии происходит резкое угнетение вазодилатирующихвлияний эндотелия, что проявляется снижением нормированных амплитудэндотелиальных колебаний.
При этом тенденция к нормализации нормированныхамплитуд эндотелиальных колебаний от 14-х к 21-м суткам, позволяетрассматривать данные изменения, как свидетельство начала регенеративныхпроцессов.3.1.2 Изменения электронейромиографических показателей седалищногонерва крыс при нейрорафии седалищного нерва [Г.А. Коршунова и др., 2016]Возникающие двигательные нарушения после нейрорафии седалищногонерва проявляются ограничением нагрузки и гипотрофией мышц оперированнойконечности.Длянарушенийиобъективнойопределенияоценкистепенидинамикивыраженностивосстановлениямоторныхпроводимостиповрежденного нерва проводили ЭНМГ-мониторинг на 7-е, 14-е и 21-е сутки.При проведении ЭНМГ-исследования на 7-е (n=7) и 14-е (n=8) сутки пристимуляции нерва выше места пересечения получить четкие невральные ответыниже зоны нейрорафии не удалось.
Только на 21-е сутки с дистального отрезкаудалось выделить ВП нерва с выраженным снижением показателя временипроведения импульса (ЛП) и амплитуды вызванного потенциала (ВП), чтосвидетельствовало о восстановлении проводимости через зону нейрорафии засчет малого числа аксонов. Средняя амплитуда ВП нерва, регистрируемая сдистального отрезка нерва не превышает 18 мкв и составляет всего 8,1% отвеличинывызванного потенциала нерва ложнооперированныхживотных.Получить вызванный мышечный ответ при стимуляции нерва не удалось (табл. 2).6061Таблица 2Показатели ЭНМГ-исследования седалищного нерва на 21-е суткив группе сравненияПоказателиЛП нерва(мс)АмплитудаВП нерва(мкв)ЛПМ-ответа(мс)АмплитудаМ-ответа(мкв)Контроль(n=12)1.8(1.45; 2.7)222.5(199; 297)3.5(3.2; 4.85)19608(14163; 21372)Группасравнения(n=16)11,25(8.45; 13.6)p1=0.00001418(12; 30)p1=0.000009--ГруппаПримечания:вкаждомслучаеприведенымедиана,верхнийинижнийквартили;р1 –по сравнению с контролемТаким образом, данные ЭНМГ-исследования свидетельствуют, что к 21-мсуткамвоперированномнервепроисходитчастичноевосстановлениепроводимости через зону нейрорафии, при этом новых синаптических контактовна мышцах не формируется.3.1.3 Анализ морфологических изменений седалищного нерва посленейрорафии [Г.А.
Коршунова и др., 2016]Для верификации нарушений, обнаруженных в ходе функциональныхисследований,былпроведенанализморфологическихизмененийвоперированном нерве в проксимальном и дистальном отделах на 21-е сутки.В проксимальном и дистальном сегментах нерва на 21-е сутки экспериментаотмечаются выраженные отеки (рис. 6А, рис. 7А), в отдельных препаратахнаблюдаются кровоизлияния.В проксимальном отделе на 21-е сутки эксперимента обнаруживаются всреднем 46 (38; 50) нервных волокон в поле зрения при увеличении 1000, изкоторых более 45% имеют дистрофические изменения (рис. 6Б).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
