Диссертация (1154652), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Юдина департаментаздравоохранения г. Москвы» (главный врач – д.м.н. Косаченко А.Г.), а основныеэтапы работы проведены в отделении экстракорпорального оплодотворения ГБУЗ«Центр планирования семьи и репродукции ДЗМ г. Москвы» (главный врач к.м.н.ЛатышкевичО.А.)иотделенииэкстракорпоральногооплодотворенияООО «Клиника ЗДОРОВЬЯ» группы компаний «Мать и дитя» (генеральныйдиректор – академик РАН, д.м.н., профессор Курцер М.А.).
Перечисленные вышеклиники оснащены современным диагностическим и лечебным оборудованиемэкспертного класса. Все лабораторные методы исследования проведены вмолекулярно-генетическом научном центре «ДНКоМ». Часть исследований иопераций проведены в урологическом отделении ГБУЗ города Москвы «ГородскаяклиническаябольницаимениС.И. Юдинадепартаментаздравоохраненияг.
Москвы».Работа основана на результатах обследования и лечения 938 пациентов сустановленным диагнозом мужского бесплодия. Из них у 174 (18,7%) мужчинвыявлена секреторная азооспермия. Эти больные были включены в основноеисследование и распределены в следующие группы:I группа — 98 (56,3%) пациентов с азооспермией, у которых по результатамбиопсии выявлен сперматогенез;II группа — 76 (43,7%) пациентов, у которых сперматогенез по результатамбиопсии не обнаружен.8Критерии включения: возраст пациентов до 44 лет; установленный фактбесплодиябез примененияконтрацепции;отсутствиеженскогофакторабесплодия у супруги; отсутствие в анамнезе двусторонних поражений яичек;отсутствие обструкции семявыносящих протоков; отсутствие генетических иэндокринных (экстрагенитальных) факторов бесплодия, наличие подписанногоинформированного согласия.Из исследования были исключены пациенты, в анамнезе у которых ранеебыла выполнена биопсия яичка.Диагностика бесплодия, как и многих других заболеваний, основана нажалобах больного, данных анамнеза и объективного статуса, а также нарезультатах специальных методов исследования.Известно, что пациентов с бесплодием, особенно с азооспермией, относят ксложным категориям пациентов из-за трудности диагностики причин и степенинарушения сперматогенеза, а также выбора методов лечения.
В связи с этимданные больные нуждаются во всестороннем обследовании.Этапы полового развития (манифестация вторичных половых признаков),сбор анамнеза жизни, выявление возможных вредных факторов на производствепозволяли исключить некоторые причины бесплодия.Андрогенный статус организма больных оценивали по показателям роста,массытела,особенностямтелосложения,темпаитипаоволосения(мужской/женский), распределению подкожно-жировой клетчатки, состояниюскелетно-мышечной системы, молочных и половых желез, соответствию тембраголоса возрасту.Кроме исследования внутренних органов по общепринятой методике,оценивались наружные половые органы с определением размера, положения иконсистенции яичек и их придатков, семенного канатика.
Проводилось пальцевоеректальное исследование предстательной железы. Все изложенное вышепозволяло оценить эндокринный статус пациента и его половую конституцию.Спермограмму выполняли всем больным не менее 2 раз в соответствии с«Руководством ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и9взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью» после 3–5-дневногополовоговоздержания[59].Известно,чтовоздержаниепередсдачейспермограммы в течение 3–5 дней наиболее оптимально, так как меньший срокприводит к заниженному объему как спермы, так и количества сперматозоидов, авоздержание более 5 дней — к снижению их подвижности и возможномуувеличению числа аномальных сперматозоидов. За 3–5 дней до сдачи анализарекомендовали прекратить прием любых алкогольных напитков, включаяслабоалкогольные напитки.
Кроме того, больным рекомендовали воздержаться отпосещения саун, парилок, горячих ванн, криокамер в течение нескольких дней доисследования эякулята. При повышении температуры тела анализ также непроводили. Кроме того, исключали прием лекарственных препаратов, которыемогут повлиять на достоверность исследования спермы, особенно седативныхсредств и антидепрессантов. Сперму собирали путем мастурбации, далееисследовали нативный препарат [101].Эякулят оценивали, проводя макроскопический анализ, включающийопределение объема эякулята, запаха, цвета, вязкости и pH. Все остальныепоказатели относят к микроскопическому анализу. Исследование проводили прикомнатной температуре (не ниже +20°С) с помощью обычного микроскопа,имеющего необходимые параметры увеличения.Обзорная микроскопия предусматривает исследование нативного препаратав камере Маклера [101].При отсутствии сперматозоидов в нативной сперме проводили повторнуюмикроскопию осадка спермы после центрифугирования.
При повышенииколичества лейкоцитов при микроскопии дополнительно исследовался секретпредстательной железы и проводился анализ мочи в 3 порциях (по стандартнымметодикам).У всех пациентов определяли следующие гормоны в сыворотке крови:тестостерон (Т) — норма 12–35 нмоль/л; ФСГ — норма 1,4–18,1 мМЕ/мл, ЛГ —норма1,5–9,3мМЕ/мл,пролактин(ПРЛ)—норма44–375мкМЕ/мл,тиреотропный гормон (ТТГ) — норма 0,4–4,0 мкМЕ/мл; глобулин, связывающий10половые гормоны (ГСПГ) — норма 7,2–100 нмоль/л.; АМГ — норма 1.5–15 нг/мл,ингибин В — норма 25–325 пг/л. Все гормоны исследовали иммуноферментнымметодом.
Определение гормонального статуса позволило выявить эндокринныйгенез инфертильности у обследуемых пациентов.Уровеньингибина Вмолекулярно-генетических"двухступенчатым"производстваопределяливисследованийлабораторииДНКом,сэндвич-иммуноанализомBecmanCoulter,DiagnosticсSystemнаучногоцентраферментно-усиленнымпомощьютест-системыLaboratories(США)иоборудования ИФА-ридер Tescam Sunrise (Австрия).
Нормы ингибина В на даннойтехнике составляли 25–325 пг/л. Методика выполнения стандартная. Материалисследования — сыворотка крови. Однако полученные нами данные об уровнеингибина В показали несостоятельность стандартных нормативов. Мы согласны смнением Anawalt B.D. и соавт., которые считают уровень ингибина В ниже 80 пг/лсвидетельством наличия репродуктивных проблем у мужчины [145].Приисследованиигормональногопрофилясоблюдалистандартныетребования: забор крови у мужчин в утренние часы, исключение приемастероидных и тиреоидных гормонов за 2 суток до исследования (по согласованиюс врачом), исключение физического и эмоционального перенапряжения и половойактивности в течение суток перед исследованием и воздержание от курения за 3 чдо сдачи крови.ОпределениемикроделецийвYхромосомепроводилиметодоммультиплексной ПЦР (мПЦР) с одновременной амплификацией несколькихфрагментов ДНК. Микроделеции в локусе AZF анализировали в 2 этапа.
НаI этапе идентифицировали полные делеции, на II — частичные делеции AZF слокуса хромосомы Y.Методы ультразвуковой диагностики позволяют не только установитьокончательный диагноз и оценить состояние регионарной гемодинамики, но ипровести дифференциальную диагностику варикоцеле с другими заболеваниями(фуникулит, гидроцеле, киста придатка яичка и другие).11УЗИ с помощью цветового допплеровского картирования (ЦДК) идопплерографиииспользовалидляопределенияобъемаяичекигемодинамических изменений в паренхиме. Ультразвуковая допплерографиятакже позволила выявить участки повышенного кровотока в паренхиме яичек, чтопомогало целенаправленно определить зону биопсии.Исследования проводили на аппаратах «Voluson E 8» фирмы «Generalelectric» с наружным (конвексным) С 1-5 датчиком частотой от 2.5-6.0 МГц инаружным (линейным) датчиком 11L с частотой 5,5–7,5 МГц.Выполнению биопсии предшествовало обязательное УЗИ органов мошонки.Любая неоднородность паренхимы яичка, обнаруженная при УЗИ у пациентов сбесплодием, делает биопсию обязательной для исключения неопластическогопроцесса.
ЦДК применяли с целью получения биопсийного материала из участковс повышенным кровоснабжением. Первым этапом оперативного пособия сталиаспирационные методы получения биоматериала из придатка или паренхимыяичка. В случае отрицательного ответа при одномоментной микроскопииаспиратов выполняли открытые методы получения биоматериала.
Через 10миллиметровый разрез белочной оболочки обнаженного яичка брали тканьразмером 0.3х0.3 см. При обнаружении подвижных сперматозоидов послемикроскопии нативного операционного материала незамедлительно выполняликриоконсервацию для последующего использования в протоколе ЭКО/ИКСИ. Приотсутствии сперматозоидов операцию заканчивали взятием материала длягистологического исследования и послойным ушиванием раны яичка. Вгистологическомпрепаратедолжныбытьпоперечныесрезынеменее30 канальцев. Глубокие швы кожи мошонки не должны раздражать белочнуюоболочку, так как это часто причиняет боль после операции. Чтобы избежатьосложнений, не следует объединять разделенные в норме пути лимфооттока кожимошонки и яичка. Необходимы также фиксация и дальнейшая обработка ткани.Для световой микроскопии полутонких срезов ткань яичка фиксируют в 5,5%глутаральдегиде, а для дополнительных иммуногистохимических исследований(например, определения щелочной фосфатазы при подозрении на карциному in12situ) — в жидкости Боуэна.
При исследовании полутонких и парафинированныхсрезов использовали фиксации в растворе I (5,5% глютаральдегид в 0,05 Мфосфатном буфере) и растворе II (1% ОsО4 в смеси фосфатного буфера ссахарозой), а затем заливали в эпоксидную смолу (глицидный эфир). Полутонкиесрезы (толщиной в 1 мкм), получаемые с помощью специального микротома(стеклянный или алмазный нож «гисто-Диотом», Diotome Ltd, Биль, Швейцария),окрашивали толуидиновым синим/пиронином или по Laczko и Levai (1975).Материал,получаемыйвходебиопсиияичка,доставляливпатогистологическую лабораторию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
