Диссертация (1154482), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Этиданные использовали для того, чтобы оценить степень влияния Ах на скоростьпролиферации в клеточной популяции.90Таблица 15Динамика прохождения фаз клеточного цикла в линии SW620Время часыКонц-ия Ах, М/лВид гистограммыРаспределение клеток в популяции0 часов0G1:47,9 %; G2:10,6%; S:41,5%88480G1:55,8 %; G2:3,0 %; S:41,2%9110-4G1:70,7%; G2:0,4 %; S:29,0 %8910-5G1:53,4%; G2:6,8%;S:39,9%9210-6G1: 56,2%; G2: 6,1%; S:37,7 %90720G1: 54,4%; G2: 8,7%; S:37,0%9310-4G1:72,3%; G2:2,6%; S:25,1%9110-5G1:54,8%; G2:6,0%S: 39,2%9410-6G1: 57,1%; G2: 5,8 %; S: 37,1%9296 часов0G1: 57,3%; G2: 1,%; S: 41,7%9510-4G1: 62,81%; G2: 0.00 %;S:37,2%9310-5G1: 61,5%; G2: 0,2%; S: 38,3%9610-6G1: 61,0 %; G2: 0.0 %; S: 39,0%9495Таким образом было установлено, что при добавлении Ах в культурупроисходили следующие изменения: (1) процент клеток, находившихся встадии G1 в группе контроля недостоверно увеличивался через 48 часов, чтобыло связано с манипуляциями, стимулирующими процесс митоза - рассевомклеток в новые культуральные флакон и сменой СК; (2) в остальныхвременных точках такого изменения не наблюдали.
Представленные данныедемонстрируют изменение длительности клеточного цикла в популяции нафоне введения Ах в изолированной системе клеток. Это наблюдение являетсяважным этапом понимания роли Ах при заживлении дефектов СО органовЖКТ, как было показано ранее [4; 91; 103; 120]. До сих пор для такогопроцесса как хроническое воспаление роль Ах недостаточно изучена.
Данныео влиянии Ах на нормальный клеточный цикл представлены в таблице 16.Таблица 16Влияние Ах на клеточный циклВремяинкубации,часы487296Кон. конц-ияАх, М% соотношение количества клеток SW620в разных фазах клеточного циклаS/G1S/G2G1/G210-40,472,3176,810-50,85,87,910-60,76,29,210-40,39,727,810-50,76,59,110-60,76,49,810-40,60-10-50,6191,5307,510-60,6--Из таблицы видно, что дозозависимый эффект при 48 часов инкубации сАх не является выраженным и к 96 часу разница в соотношении S/G1практически пропадает. Для соотношения S/G2 темпоральный эффект96становится более выраженным: через 48 часов экспозиции с Ах в конечнойконцентрации 10-4М выявляется стимулирующее действие Ах на клеточнуюпопуляцию и увеличение процента клеток в стадии S. Для соотношения G1/G2определить характер действия Ах становится невозможным к 96-ому часу, в товремя как изменения, характерные для 48 и 72 часов не отличались.Полученные данные позволяют заключить, что максимальный биологическийэффект от Ах выявляется in vitro при экспозиции клеток 72 часа.
Через этовремя возникает феномен перехода клеточной популяции из стадии S, встадию G1.Таким образом, проведенные исследования in vitro на клеточной линииSW620 позволили выявить что действие Ах как слабого митогенна in vitroявляется кратковременным, локальным и необратимым. Наиболее выраженноевлияние можно обнаружить при концентрации вещества 10‾⁴-10‾6М. Степеньвоздействия Ах зависит от внешних условий среды: рН среды, плотностипосадки клеток и площади флакона, наличия полноценной буферной системыиэкзогенногопоступленияпитательныхвеществ.Пролиферативнаяактивность клеток после однократного применения Ах достигает максимума ктретьим суткам (72-ой час), и продолжается до 96 часа.3.2.
Влияния ацетилхолина на рост и развитие полипов толстой кишки укрысУчитывая наблюдавшиеся in vitro эффекты от применения Ах, былопринято решение о начале исследования его роли в канцерогенной модели сприменением1,2-азоксиметананакрысах,находившихсявразныхпатофизиологических условиях.Работа проводилась в несколько этапов.Задачами первого (подготовительного) этапа являлись:(1) определение условий проведения оперативного вмешательства;(2) определение и профилактика основных осложнений послеоперационногопериода; изучение степени вовлеченности Ах в процесс заживления раны;97(3) оценка динамики колебаний концентрации Ах в окружающих тканях;(4) уточнениетоксическогодействияканцерогенноговещества(1,2-аоксиметан или АОМ) для индукции роста полипов; определение рабочихконцентраций и кратность введения для индукции роста полипа;На подготовительном этапе проводилась патологоанатомическая иморфологическаяживотных:оценкаизучалибиологическогодинамикуизмененияматериала,веса,полученногоаппетитиотосновныефизиологические параметры восстановления после операции, отрабатывалиметоды хирургических манипуляций и переносимость шовного материала,определяли необходимую кратность и сроки ведения АОМ для инициациироста полипов, но не аденокарцином.В дальнейшем были поставлены задачи второго этапа:(1) уточнить особенности роста полипа на фоне изменения уровня Ах;(2) определить в патологическом материале концентрацию фактора ростаэпителия (EGF);(3) определить в патологическом материале концентрацию матриксныхметаллопротеиназ 3 и 9 типа (ММР-3 и ММР-9);(4) сопоставить данные с данными предварительных исследований in vitro.3.2.1.Патофизиологическиеизменениявнутреннихоргановпримоделировании язвы толстой кишкиПри моделировании язвы толстой кишки у крыс Wistar, былоопределено, что наложение аппликатора с последующим внесением уксуснойкислоты приводит в первые секунды к формированию зоны ишемии внутриокошка аппликатора и резкому расширению сосудов вокруг этого участкапосле удаления ограничителя.
Так как аппликатор хорошо удерживал внутринеобходимый объем кислоты, то область воздействия была ограничена, аместовоздействиявплотьдо21сутокхорошоопределялосьпримакроскопическом обследовании кишки. Последовательность манипуляцийпредставлена на рисунке 13.98Рисунок 13 Последовательность манипуляций А. Индуцированная язва; Б.Наложение швов и послеоперационная обработка шва; В.
мягкая фиксацияживотного для осмотра на 10-ый день; Г. Общий вид трупа. Внешний видбрюшка и места шва; измерение размера трупа крысы; Д. Увеличенный вид натолстую кишку после индукции язвы: (1) Место нанесения 100%уксуснойкислоты: отек серозной оболочки (2) Интактная толстая кишка ниженанесения уксусной кислоты (3) Интактная слепая кишка.На этом этапе так же были определены типичные показатели изменениявеса (таблица 17) и внешнего вида органов к концу эксперимента присравнении интактной группы (контроля) и группы с индуцированной язвой.Также были определены основные морфологические изменения со стороныслизистой оболочки толстой кишки.99Таблица 17Динамика показателей животных перед началом эксперимента и в деньего завершения *- р≤0,05Масса тела, г0 деньГруппаСроквосстановления70-ыйполнойживотныхМе.(25;75)%Ме.(25;75)%двигательнойактивностиИнтактныеn=26Язваn=26258,5255,0; 261,0268,5* 260,0; 270,0263,5258,0;268,5268,5Не менялся258,0;273,021 день* - достоверное увеличение веса животных р=0,02 (регрессионный анализ ANOVA);Оценка общего внешнего вида животных показала, что несмотря на то,что послеоперационный рубец формировался полноценно, а его наличие ужене определялось к 12-ому полсеоперационному дню (рисунок 13, фотографияВ), зоотехнические параметры животных с язвой отличались от таковых вгруппе интактных крыс.
Прооперированные животные имели тенденцию кпотере веса, в то время как интактные вес набирали.Из таблицы 17 видно, что животные группы» интактные» набирали вес(100%), в то время как крысы опытной группы (70%) имели тенденцию кпотере веса.
У трех животных из «язва» (всего 24 крысы) наблюдали наборвеса,которыйбылсвязансвыявленнымятрогеннымнарушениеманатомической структуры СлК: при осмотре их трупов было установленоувеличение еѐ объема до 25 см³, что было связано с образованием сужениятолстойкишкивместеналоженияаппликатора – образованиепослеоперационной стриктуры.
Признаков формирования спаек между слепойи толстой кишкой у прооперированных животных не выявляли, органы малоготаза сохраняли свои функции.100При анализе результатов некропсии было установлено, что примоделировании язвы, образовавшиеся поражения толстой кишки были хорошовидны невооруженным глазом до 21-22 дня. Типичная картина слизистойповерхности толстой кишки представлена на рисунке 14.АБВГРисунок 14 Пример наиболее типичных изменений слизистой оболочкитолстой кишки крыс.
Внешний вид слизистой оболочки толстой кишки. А –контроль, Б – 72 часа (павшее животное); В - 7-ые сутки, Г - внутренняяповерхность толстой кишки после фиксации в 10% формалине. Краснымвыделена область язвы.К 70-ому дню описанные изменения можно было установитьориентируясь на расстояние от выхода из слепой кишки и очень слабо101заметному участку ишемии серозной оболочки. Типичным изменениемтолстой кишки являлась расширение области выхода слепой кишки,изменение консистенции каловых масс и образование участков истончениястенки толстой кишки.Длягруппыпредставленностьинтактныхвсрезахживотныхбылаиммунокомпетенныххарактераклетокобильнаяприобщейсохранности анатомоморфологической целостности структур слизистойоболочки.
При морфологической оценке и сравнении тканей толстой кишкигруппы «язва» с образцами тканей, полученных от интактных животных(рисунок15),определялиналичиезондесквамации,лимфоиднойпролиферации, областей с полностью разрушенными ворсинками, набуханиемклеток, составляющих структуру крипты (рисунок 16).Рисунок 15 Толстая кишка. Окраска гематоксилин-эозин.
Увеличениеокуляром х40 (А) х10(Б) и х40 (В) Поверхность слизистой оболочки и стенкакрипт А. Образец тканей от интактных животных; Б. – образец слизистойоболочки интактных животных, 1 см от выхода из слепой кишки; В – образецБ, увеличенный участок. Увеличение окуляром х40. (1) Выстилкаоднослойным цилиндрическим каѐмчатым эпителием с многочисленнымибокаловидными клетками.
Мышечный слой слизистой оболочки (2)внутреннийциркулярныйинаружногопродольныйподслоѐвгладкомышечных клеток.Таким образом, было установлено, что в группе с индуцированнымязвой были обнаружены изменения, характерные для воспалительной реакциидаже на 70-ый послеоперационный день.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
